Công cụ chẩn đoán ELISA (2/2): Diễn giải kết quả

Cân nhắc trong việc giải thích kết quả:

• Cần có thời gian để heo tiếp xúc với mầm bệnh (virus thực địa hoặc từ vaccine) tạo ra đủ kháng thể để ELISA phát hiện (thường ít nhất 2-4 tuần sau khi tiếp xúc tùy thuộc vào mầm bệnh và kháng thể đích).
• Xét nghiệm ELISA kháng thể không thể phân biệt kháng thể mẹ truyền (kháng thể thụ động) với kháng thể do tiếp xúc (kháng thể chủ động).
• Xét nghiệm ELISA kháng thể thường không thể phân biệt được kháng thể do vaccine với kháng thể do tiếp xúc với virus thực địa.
• Trong một số trường hợp, các xét nghiệm ELISA đặc biệt có thể được phát triển để phân biệt giữa động vật đã được tiêm phòng và động vật nhiễm bệnh (vaccine DIVA - differentiate infected from vaccinated animals).
• Kết quả ELISA kháng thể không ám chỉ động vật được bảo hộ. Khả năng bảo hộ có thể đến từ các kháng thể khác nhau mà có thể không đo được bằng xét nghiệm hoặc bằng miễn dịch qua trung gian tế bào, hoàn toàn khác với miễn dịch dịch thể hoặc qua trung gian kháng thể và không được đo bằng xét nghiệm ELISA.
• ELISA kháng nguyên kém nhạy hơn đáng kể (độ nhạy phân tích thấp) trong việc phát hiện kháng nguyên so với PCR. Xét nghiệm PCR chủ động sao chép DNA/RNA có mặt và do đó có thể phát hiện virus hoặc vi khuẩn ở mức cực thấp. Mặt khác, ELISA kháng nguyên yêu cầu nồng độ virus hoặc vi khuẩn cao hơn đáng kể để có thể tạo ra đủ sự thay đổi màu sắc mà nó có thể được phát hiện.
• Các kết quả được chuẩn hóa và thường nhất quán giữa các phòng thí nghiệm khi sử dụng các bộ xét nghiệm ELISA được sản xuất thương mại (có sẵn và được sử dụng rộng rãi). Các xét nghiệm ELISA trong phòng thí nghiệm nội bộ có thể tạo ra sự khác biệt lớn về kết quả trừ khi thực hành sản xuất được tiêu chuẩn hóa và tuân thủ cao.
• Không phải tất cả mầm bệnh đều tạo ra phản ứng miễn dịch có thể đo lường được.
• Mỗi bộ ELISA thường sẽ xét nghiệm các protein khác nhau có thể tạo ra kết quả rất khác nhau cho cùng một mẫu. Một ví dụ đáng chú ý cho điều này là có nhiều sự khác biệt trong các bộ xét nghiệm ELISA kháng thể Mycoplasma hyopnemoniae; chắc chắn không phải tất cả các bộ dụng cụ đều được tạo ra như nhau.
• Liều lượng và/hoặc đường tiếp xúc có thể ảnh hưởng đến mức độ đáp ứng miễn dịch (mức độ sản xuất kháng thể).
• Điều quan trọng cần biết là độ nhạy của xét nghiệm được báo cáo (khả năng phát hiện dương tính thật) và độ đặc hiệu (khả năng xác định âm tính thực sự là âm tính; không có phản ứng chéo).
• Kết quả dương tính giả và âm tính giả có thể xảy ra do mức độ tiếp xúc và phản ứng miễn dịch với mầm bệnh khác nhau giữa các cá thể heo (phân bố bình thường) và thường có một số phản ứng nền hoặc phản ứng chéo không thể loại bỏ hoàn toàn (Xem Hình 1).
• Các kháng thể thường tồn tại/có thể đo lường được trong vài tháng sau khi tiếp xúc/tiêm chủng.

Kết quả âm tính

• Mẫu/đàn thật sự âm tính với mầm bệnh (không phơi nhiễm và không tiêm vaccine).
• Mẫu/đàn thực sự âm tính với mầm bệnh mặc dù động vật có thể được tiêm phòng (nếu xét nghiệm có khả năng DIVA) (Chỉ ELISA kháng thể).
• Không đủ kháng nguyên có trong mẫu để phát hiện (Chỉ ELISA kháng nguyên).
• Mẫu được lấy quá sớm khi mới mắc bệnh và heo chưa thể tạo ra phản ứng miễn dịch có thể phát hiện được (Chỉ ELISA kháng thể).
  • PRRS thường cần 7-10 ngày để chuyển hoá huyết thanh xảy ra.
  • Lawsonia intracellularis thường cần 4-6 tuần để chuyển đổi huyết thanh xảy ra tùy thuộc vào liều lượng tiếp xúc.
• Mẫu được lấy quá muộn và mầm bệnh không còn xuất hiện nữa.
  • Virus cúm chỉ hiện diện trong nước mũi trong 3-4 ngày đầu tiên.
• Sự không phù hợp giữa kháng thể/kháng nguyên đích.
  • Các chủng cúm khác nhau (Sự khác biệt giữa H1N1 và H3N3 và cả sự khác biệt giữa các nhóm H1N1 khác nhau).
• Tỷ lệ lưu hành thấp trong đàn và (các) động vật được lấy mẫu không bị nhiễm bệnh.
  • Cần tăng số lượng động vật được lấy mẫu.
• Bệnh cụ thể có thể không kích thích đủ kháng thể để phát hiện.
  • Mycoplasma hyopneumoniae chủ yếu gắn vào lông mao trong phổi và không kích thích sản xuất nhiều IgG trong huyết thanh.
    • Nhiễm trùng thực địa còn mới tạo ra kết quả ELISA mạnh hơn nhiều.
  • Vaccine Mycoplasma hyopneumoniae không kích thích đáp ứng miễn dịch IgG mạnh.
    • Các xét nghiệm ELISA khác nhau phát hiện vaccine khác nhau.
    • Thông thường chỉ có khoảng 30% động vật được tiêm phòng sẽ chuyển hoá huyết thanh.
• Mẫu dương tính yếu bị pha loãng do gộp.
  • Hoàn toàn không khuyến khích gộp các mẫu!

Mẫu dương tính

• Mẫu/đàn thực sự dương tính với phơi nhiễm mầm bệnh.
• Không thể phân biệt nếu mẫu là lây nhiễm hoặc không lây nhiễm.
• Không thể phân biệt kháng thể mẹ truyền với phơi nhiễm tự nhiên hoặc tiêm chủng.
  • Hầu hết các kháng thể mẹ truyền biến mất sau 8-12 tuần tuổi
  • Khi heo già đi, các giá trị ELISA sẽ giảm đáng kể theo thời gian
  • Có thể xét nghiệm heo qua thời gian để xác nhận sự suy giảm kháng thể của heo mẹ cũng như không có tiếp xúc với mầm bệnh thực địa (không có nhiễm trùng mới)
• Tùy thuộc vào mầm bệnh mục tiêu, việc phát hiện protein (kháng nguyên/kháng thể) không phải lúc nào cũng xác nhận bệnh
  • Huyết thanh để xét nghiệm ELISA kháng thể dương tính với circovirus heo loại 2 (PCV2), xác nhận phơi nhiễm với PCV2 ở cả heo được tiêm phòng hoặc bị nhiễm bệnh (cả hai đều khá phổ biến) nhưng không xác nhận liệu triệu chứng còi cọc hoặc bệnh có phải do PCV2 hay không hoặc liệu vaccine có thất bại hay không. Cần làm giải phẫu bệnh mô miễn dịch phổi và hoặc mô bạch huyết để chứng minh bệnh liên quan đến PCV2.
  • Xét nghiệm có thể không phân biệt được việc tiếp xúc với virus/vi khuẩn trong vaccine sống nhược độc với nhiễm trùng thực địa (Chỉ ELISA kháng thể)
    • Áp dụng cho cả vaccine chết và vaccine sống nhược độc
    • Hữu ích trong việc biết thời điểm sử dụng vaccine là mặc dù không quan trọng vì heo có thể vẫn dương tính với một số bệnh trong một thời gian dài (nhiều tháng)
• Nhiễm chéo khó xảy ra vì cần một lượng lớn vấy nhiễm để tạo ra kết quả dương tính (phụ thuộc vào nồng độ)

• Một giá trị ELISA duy nhất có thể không xác định đầy đủ giai đoạn nhiễm trùng (cần bệnh sử)
  • Xem Hình 2
  • X = giá trị ELISA
  • Ba thời điểm khác nhau trong một đợt bùng phát có thể tạo ra cùng một giá trị ELISA nhưng cách giải thích và các hành động cần thiết sẽ hoàn toàn khác nhau:
    • Điểm A – Dễ lây nhiễm – đang bắt đầu bùng phát; có thể hành động
    • Điểm B – Nhiễm muộn – sắp hết dịch; không có nhiều việc phải làm vào thời điểm này
    • Điểm C – Đợt bùng phát thứ hai – đợt bùng phát thứ hai đang bắt đầu, phải thực hiện các biện pháp thực hành an toàn sinh học/giải quyết lý do tái bùng phát
• Có thể cần lấy mẫu thứ hai từ cùng một con heo sau 10 ngày đến 2 tuần để xác định thêm giai đoạn bùng phát (cùng với bệnh sử)
  • Nếu kết quả mẫu thứ hai cao hơn, thì có khả năng tại điểm A
  • Nếu kết quả mẫu thứ hai cao hơn đáng kể, thì có khả năng tại điểm C
  • Nếu kết quả mẫu thứ hai không thay đổi, khả năng trong pha cân bằng
  • Nếu kết quả mẫu thứ hai đi xuống, thì có khả năng tại điểm B
• Giá trị S:P cao thường có thể liên quan đến lần phơi nhiễm gần đây hơn
  • Đặc biệt là sau lần phơi nhiễm thứ hai hoặc tiêm nhắc lại (Xem Hình 2) (Chỉ ELISA kháng thể.
  • Điều quan trọng cần lưu ý là chỉ vì nhiễm trùng mới xảy ra thì không có nghĩa là mầm bệnh vẫn còn (nghĩa là heo đang nhiễm virus huyết hoặc nhiễm khuẩn huyết) (Chỉ ELISA kháng thể)
  • Điều này đặc biệt đúng đối với virus Hội chứng hô hấp và sinh sản ở heo (PRRS).
    • Heo có thể có ELISA âm tính và chưa có virus huyết
    • Heo có thể có giá trị kháng thể ELISA cao và không bị nhiễm virus
    • Xét nghiệm PCR được sử dụng để hiểu tình trạng nhiễm virus huyết của heo
• Giá trị S:P thấp
  • Bệnh cụ thể có thể không kích thích đủ kháng thể để phát hiện
    • Mycoplasma hyopneumoniae chủ yếu gắn vào lông mao trong phổi và không kích thích sản xuất nhiều IgG trong huyết thanh
      • Nhiễm trùng thực địa còn mới tạo ra kết quả ELISA mạnh hơn nhiều
    • Vaccine Mycoplasma hyopneumoniae không kích thích đáp ứng miễn dịch IgG mạnh
      • Các xét nghiệm ELISA khác nhau phát hiện vaccine khác nhau
      • Thông thường chỉ có khoảng 30% heo được tiêm phòng sẽ chuyển hoá huyết thanh
  • Heo được điều trị bằng kháng sinh trong vài tuần có thể ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn trong thời gian đó, do đó làm giảm khả năng phơi nhiễm bệnh (nhưng không loại bỏ) dẫn đến phản ứng miễn dịch chậm hơn hoặc yếu hơn khi phơi nhiễm
    • Sử dụng kháng sinh chống Mycoplasma hyopneumoniae giai đoạn đầu và giữa lứa tuổi cai sữa
    • Sử dụng kháng sinh chống lại các tác nhân gây bệnh đường ruột như Lawsonia intracellularis giai đoạn đầu và giữa lứa tuổi cai sữa