PCR - một công cụ chẩn đoán bệnh heo (2/2): Sử dụng và giải thích kết quả

Một số công dụng của xét nghiệm PCR:

• Phát hiện sự hiện diện của DNA/RNA của đối tượng mầm bệnh - Cách sử dụng phổ biến nhất

• Định danh serotype (loại huyết thanh) một mầm bệnh bằng cách nhắm mục tiêu các gen cụ thể (DNA/RNA) được biết là khác nhau giữa các serotype (ví dụ: gen tổng hợp vỏ bọc cho Actinobacillus pleuropneumoniae)

• Phát hiện sự hiện diện của các gen độc lực (ví dụ: xác định kiểu gen E. coli)

Điều quan trọng cần nhớ là xét nghiệm PCR chỉ phát hiện sự hiện diện của vật liệu di truyền được nhắm mục tiêu dựa trên đoạn mồi (primer) và không cho biết liệu sinh vật có thể lây nhiễm hay không. Khi xét nghiệm gen, xét nghiệm chỉ phát hiện sự hiện diện của gen mà không phát hiện được sinh vật có biểu hiện yếu tố độc lực hay không.

Trong những năm gần đây, PCR đa mồi (multiplex PCR) đã được các phòng thí nghiệm phát triển để kiểm tra nhiều mầm bệnh hoặc nhiều chủng/gen của cùng một mầm bệnh cùng một lúc. Các PCR đa mồi này là nhiều PCR đang được chạy cùng một lúc. Chi phí của chúng cao hơn so với các PCR riêng lẻ nhưng rẻ hơn đáng kể so với việc chạy các PCR riêng lẻ vì tiết kiệm đáng kể cho phòng thí nghiệm về việc sử dụng thiết bị, nhân viên phòng thí nghiệm và sử dụng chất phản ứng. Phòng thí nghiệm sẽ sử dụng các chỉ thị (marker) khác nhau để giúp xác định kết quả dương tính nào thuộc về đoạn mồi nào. Thông thường, các PCR đa mồi này có ý nghĩa chẳng hạn như kiểm tra kiểu gen của E. coli trong đó khoảng 14 gen có thể được đánh giá trên cùng một chủng vi khuẩn cùng một lúc. Một ví dụ khác là thử nghiệm cả PRRS type 1 và type 2 cùng một lúc. Một kế hoạch xét nghiệm phổ biến khác là xét nghiệm bệnh PED và coronavirus delta ở heo đồng thời. Điều quan trọng cần lưu ý là việc phát triển các xét nghiệm này không phải lúc nào cũng dễ dàng vì phòng thí nghiệm cần đảm bảo rằng không có sự cản trở nào giữa các xét nghiệm PCR khác nhau. Đó là nhiệt độ chu kỳ và các đoạn mồi khác nhau được sử dụng không ức chế hoặc phản ứng chéo với nhau. Mỗi PCR đa mồi này phải được xác nhận trước khi sử dụng và phải thực hiện tối ưu hóa đáng kể xét nghiệm.

Cân nhắc trong việc giải thích kết quả:

Một trong những thách thức đối với xét nghiệm PCR là mỗi phòng thí nghiệm thường có một quy trình xét nghiệm mẫu khác nhau, có thể bao gồm sự khác biệt trong quy trình trích xuất DNA/RNA, sự khác biệt trong quy trình chạy chu kì cũng như sự khác biệt về đoạn mồi được sử dụng. Điều này có thể gây khó khăn cho việc so sánh chặt chẽ các kết quả thu được từ các phòng thí nghiệm khác nhau.

Kết quả âm tính

• Mẫu/đàn thực sự âm tính với mầm bệnh
• Đảm bảo mẫu đã được gửi cho đối tượng mầm bệnh được thu thập đúng cách. Một số ví dụ cổ điển để xem xét:
  • Virus cúm không gây nhiễm toàn thân và do đó sẽ không được tìm thấy trong các mẫu máu.
  • Xét nghiệm dịch hầu để tìm Mycoplasma hyopneumoniae hiếm khi cho kết quả dương tính vì mầm bệnh thường bám vào các lông mao (cilia) nằm trong đường hô hấp dưới
  • Chỉ gửi 1 bào thai từ một ổ sảy thai bởi PRRS (chỉ có 50% cơ hội dương tính), nên gửi ít nhất 4 bào thai để tối đa hóa cơ hội tìm thấy mẫu dương tính
• Mẫu thu thập quá muộn khi bệnh và mầm bệnh không còn nữa.
  • Virus cúm chỉ hiện diện trong dịch tiết mũi trong 3-4 ngày đầu
• Đoạn mồi không khớp
  • Chủng PRRS mới
• Tỷ lệ lưu hành thấp trong đàn và (các) con heo được lấy mẫu không bị nhiễm bệnh
  • Cần tăng đáng kể số lượng heo được lấy mẫu
• Pha loãng mẫu dương tính yếu do gộp chung
  • Gộp dịch hầu theo cách truyền thống là đã pha loãng mẫu (xét nghiệm nhiều heo và giá trị Ct vốn được dự đoán sẽ cao trong các mẫu dương tính)

Mẫu dương tính

• Mẫu/đàn thực sự dương tính với mầm bệnh
• Không thể phân biệt nếu mẫu lây nhiễm hay không lây nhiễm
• Tùy thuộc vào đối tượng mầm bệnh, việc phát hiện DNA/RNA không phải lúc nào cũng xác nhận bệnh
  • PCR mô phổi dương tính với Mycoplasma hyopneumoniae xác nhận sự hiện diện của sinh vật trong mô nhưng không xác nhận mức độ nghiêm trọng hoặc ý nghĩa lâm sàng của mầm bệnh. Trong hầu hết các đàn, (không bao gồm các đàn âm tính với Mycoplasma) cần xác nhận trực quan tỷ lệ tổn thương phổi (đánh giá đại thể) để xác định ý nghĩa lâm sàng của các phát hiện.
  • Huyết thanh PCR dương tính với Circovirus type 2 trên heo (PCV2) xác nhận sự hiện diện của PCV2 nhưng không xác nhận liệu heo còi cọc hoặc viêm phổi có phải do PCV2 hay không, hoặc đã làm vaccine thất bại. Cần làm mô bệnh học miễn dịch của phổi và hoặc mô bạch huyết để chứng minh bệnh liên quan đến PCV2.
  • Xét nghiệm có thể không phân biệt được virus/vi khuẩn từ vaccine sống nhược độc với nhiễm trùng tự nhiên.
    • Điều quan trọng là phải biết thời gian và loại vaccine được sử dụng
    • Thông tin trình tự có thể cần thiết
• Vấy nhiễm chéo nếu mẫu không được xử lý đúng cách
  • Đặc biệt đúng khi thực hiện gộp các mẫu. Việc gộp chung nên được thực hiện dưới tủ thao tác an toàn sinh học (lab hood).
  • Các mẫu phân lấy từ sàn nhà có thể bị vấy nhiễm chéo với tàn tích của mầm bệnh trong môi trường
• Giá trị Ct thấp có liên quan đến nồng độ virus/vi khuẩn cao trong mẫu và thường có thể có khả năng liên quan đến bệnh lâm sàng cao hơn
  • Giá trị Ct thấp của Lawsonia intracellularis trong phân có nhiều khả năng liên quan đến tổn thương ruột.
    • Ct <20 → Bệnh viêm ruột tăng sinh
    • Ct> 30 → Không phát hiện tổn thương ruột

Xác định kiểu gen

• Việc sử dụng PCR xác định kiểu gen đang trở nên phổ biến hơn, đặc biệt là đối với E. coli. Nó cung cấp thông tin dịch tễ học liên quan đến những thay đổi trong các chủng phân lập ảnh hưởng đến đàn (ví dụ: Cúm H1N1 vs H3N2).
• Thông thường, kết quả phân tích kiểu gen được sử dụng để giúp lựa chọn vaccine để sử dụng, chẳng hạn như với E. coli (xác nhận pili).
• Điều quan trọng cần nhớ là kết quả chỉ đại diện cho một dòng phân lập duy nhất và thường heo bị nhiễm nhiều dòng phân lập cùng một lúc.
• Việc phát hiện chỉ xác nhận sự hiện diện của các gen độc lực nhưng không xác nhận sự biểu hiện của nó. Thường chỉ cần biết nó có tiềm năng di truyền để biểu hiện gen là đủ tốt.
• Khi chi phí và sự dễ dàng của việc xác định trình tự gen tiếp tục giảm, việc sử dụng hoặc nhu cầu xác định kiểu gen bằng PCR sẽ giảm xuống

.