Việc sử dụng xét nghiệm sinh học phân tử, hay phản ứng chuỗi polymerase – PCR, là một trong những công cụ chẩn đoán phổ biến nhất được sử dụng ngày nay trong thú y ngành heo. PCR không chỉ được sử dụng cho mục đích chẩn đoán mà còn là phương tiện để cải thiện an toàn sinh học thông qua giám sát và theo dõi dịch bệnh. Do đó, điều quan trọng là phải hiểu được những điểm mạnh và điểm yếu của công nghệ này khi giải thích kết quả. Cũng cần nhớ rằng mặc dù chúng ta đang dùng cùng một công nghệ cho các tác nhân gây bệnh khác nhau, nhưng sẽ có sự khác biệt trong cách giải thích các kết quả này.
Thông tin xét nghiệm
Xét nghiệm PCR được thiết kế để phát hiện vật liệu di truyền (DNA hoặc RNA) của vi khuẩn hoặc virus. Quá trình bắt đầu bằng việc tách chiết DNA hoặc RNA từ mẫu, sau đó được đưa qua các chu kỳ khuếch đại nhiệt. Nếu vật liệu đích là RNA, bước đầu tiên sẽ là chuyển RNA thành DNA (về mặt kỹ thuật được gọi là cDNA). Các chu trình nhiệt nhằm tạo ra một quy trình 3 bước gồm 1) biến tính, 2) gắn mồi và 3) kéo dài dẫn đến sự nhân đôi của vật liệu DNA có trong mẫu. Vì vậy, với mỗi chu kỳ (1 Ct), giả sử hiệu suất 100% sẽ có hai lần ADN có mặt. Mục tiêu sau đó sẽ là tiếp tục quá trình khuếch đại cho đến khi có đủ DNA được phát hiện để mẫu thử nghiệm dương tính hoặc cho đến 30 - 40 chu kỳ tùy thuộc vào thiết kế của xét nghiệm cụ thể được sử dụng.
Quá trình tách chiết là một bước quan trọng của xét nghiệm PCR vì nó tác động đến số lượng và chất lượng của vật liệu di truyền trong mẫu được thử nghiệm. Điều quan trọng là sử dụng quy trình tách chiết thích hợp cho loại mẫu đang được thử nghiệm (huyết thanh, dịch xoang miệng, mô, v.v.). Bước 2 của quá trình khuếch đại (quá trình gắn mồi) yêu cầu sử dụng mồi là các đoạn DNA ngắn được thiết kế đặc biệt để chỉ gắn và giúp tái tạo trình tự di truyền cụ thể của đối tượng mầm bệnh đang hướng đến. Đối với các mầm bệnh liên tục phát triển về mặt di truyền (chẳng hạn như virus PRRS), các đoạn mồi này phải được cập nhật định kỳ để đảm bảo vẫn phát hiện được các chủng mới.
Giới hạn (cutoff) chu kỳ xét nghiệm (thường khoảng 30-40) được thiết lập để công nhận rằng nếu quá trình khuếch đại tiếp tục, cuối cùng xét nghiệm sẽ chuyển sang dương tính chỉ đơn giản là do quá trình gắn mồi và kéo dài tự phát sẽ bắt đầu xảy ra. Điều này cho thấy rằng các kết quả dương tính yếu, giá trị Ct cao gần với ngưỡng giới hạn, cần được xem xét đặc biệt khi giải thích kết quả, đặc biệt là vào giai đoạn cuối của đợt dịch.
Có hai cách sử dụng xét nghiệm PCR khác nhau trong thú y ngành heo. PCR dựa trên gel (gel-based) truyền thống và PCR thời gian thực (real-time PCR) hiện đại hơn. Cả hai xét nghiệm đều hoạt động giống nhau, dựa trên sự khuếch đại của DNA hoặc RNA. Sự khác biệt là với xét nghiệm dựa trên gel chúng ta chỉ "đọc" kết quả một lần vào cuối quá trình xét nghiệm trong khi với PCR thời gian thực, kết quả xét nghiệm được "đọc" sau mỗi chu kỳ. Ưu điểm của PCR thời gian thực là nó cho ra kết quả định lượng/bán định lượng.
Gộp mẫu để xét nghiệm
Xét nghiệm PCR có khả năng phát hiện một lượng nhỏ vật chất di truyền trong mẫu (độ nhạy phân tích) do nó có quá trình khuếch đại vật liệu di truyền trong mẫu. Điều này tạo cơ hội để ta có thể đánh giá nhiều mẫu với một xét nghiệm duy nhất (gộp chung). Điều quan trọng cần nhớ là gộp chung, theo định nghĩa, sẽ làm loãng mẫu được đánh giá. Điều này sẽ không thành vấn đề khi nồng độ dự kiến của một mầm bệnh cụ thể cao (đặc biệt là trong các đợt nổ dịch sớm). Việc gộp chung có thể là một vấn đề khi nồng độ mầm bệnh trong một mẫu dương tính thấp chẳng hạn như ở giai đoạn cuối của đợt dịch hoặc trên một loại mẫu mà nó đã được cho là đã được pha loãng (dịch xoang miệng).