1
Xét nghiệm axit nucleic đã trở thành tiêu chuẩn để xác định sự hiện diện của mầm bệnh trong các mẫu chẩn đoán. Một quy trình xét nghiệm axit nucleic phổ biến được sử dụng trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán và nghiên cứu là phản ứng chuỗi polymerase hoặc PCR. PCR là một quy trình từng bước khuếch đại một đoạn DNA nhỏ đến mức có thể phát hiện được dưới dạng dải trên mảnh gel hoặc dưới dạng tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được bằng máy và có thể được thực hiện trong vài giờ. Cần phải có chi phí đáng kể cho các thiết bị chuyên dụng như máy điều nhiệt, phòng thí nghiệm chuyên dụng và kỹ thuật viên được đào tạo và có kinh nghiệm để thực hiện PCR tốt.
LAMP là gì?
Khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng lặp (LAMP) đã nổi lên như một phương pháp phát hiện và khuếch đại DNA/RNA đơn giản, nhanh chóng, nhạy và chính xác, không cần thiết bị phức tạp và tương đối rẻ tiền. Phản ứng được thực hiện trong một ống ly tâm đơn lẻ. Thiết bị cần thiết cho LAMP đơn giản là pipet, pipet dùng một lần và máy ủ nhiệt khô. Một thùng nước hoặc máy ủ thông thường hoặc thậm chí cả bình giữ nhiệt chứa nước nóng cũng có thể đủ làm nguồn giữ nhiệt nhưng để dễ dàng vệ sinh axit nucleic trong phòng thí nghiệm, nên sử dụng máy ủ nhiệt khô (Hình 1).
Trong một ứng dụng điển hình của LAMP, hỗn hợp trong ống xét nghiệm sẽ bao gồm:
- Sáu đoạn DNA được gọi là mồi phù hợp với trình tự DNA cần phát hiện.
- Enzym polymerase đặc hiệu (ví dụ BST DNA polymerase
- Chất đệm
- Chất bổ trợ phản ứng
- Thuốc nhuộm chỉ thị (chỉ thị pH hoặc thuốc nhuộm DNA trực tiếp)
- Phiên mã ngược đối với virus RNA
- Mẫu xét nghiệm.
Hỗn hợp này được ủ ở 60-65°C trong 30 phút. Nếu DNA khớp với mồi có trong mẫu thì một loạt các vòng DNA hình quả tạ sẽ được tạo ra. Các vòng lặp trở nên phức tạp hơn và nhiều hơn khi phản ứng khuếch đại diễn ra (Hình 2).
Quá trình khuếch đại polymerase tạo ra magie pyrophosphate là một phụ phẩm gây ra độ đục (vết đục) trong ống nghiệm. Thuốc nhuộm chỉ thị liên kết trực tiếp với DNA cho tín hiệu quang phổ nhìn thấy được hoặc tín hiệu huỳnh quang UV. Một hệ thống LAMP sử dụng chất chỉ thị pH màu đỏ phenol, chất chỉ thị này chuyển từ màu đỏ hồng sang màu vàng.
Hình 3 cho thấy kết quả của xét nghiệm LAMP đối với bệnh dịch tả heo châu Phi (ASF) - Ống A chứa dịch chiết từ lá lách của một con heo nái chết vì ASF. Hàm lượng DNA virus cao tạo ra màu vàng đục. Ống B là một miếng gạc dịch miệng có lượng virus ASF thấp hơn điển hình từ cùng một con heo nái. Độ đục trong ống A & B thể hiện rõ do đường kẻ trên nền phía sau bị che đi. C đến F là ống nghi ngờ và âm tính.
Có một số cải biến của phản ứng LAMP cho các loại công cụ khác nhau. Xét nghiệm có thể được áp dụng trong các khay vi thể 96 giếng có nắp kín với thuốc nhuộm đo màu hoặc huỳnh quang hoặc đo độ đục để đưa ra kết quả định lượng và tự động. Các cảm biến lọc trong máy ủ nhiệt và đèn LED phù hợp cũng có thể tự động hóa việc đọc huỳnh quang bán định lượng theo thời gian thực của các ống ly tâm. Camera quang phổ gắn trên điện thoại di động có thể đọc các ống nghi ngờ thành 2 dạng kết quả có/không trong một số trường hợp mà mắt người không thể phân biệt chính xác.
Phản ứng LAMP có thể được thực hiện ngay tại trại để có kết quả thực tế “tại chỗ” với thời gian chờ đợi tối thiểu. Phòng thí nghiệm của chúng tôi đã xây dựng và xác minh các xét nghiệm LAMP có chi phí thấp (bắt đầu từ “số không” và từ “bộ kit”) cho Bệnh Dịch tả heo Cổ điển (CSF), Porcine Circovirus 2 (PCV2) và ASF (như trên) làm minh chứng về khả năng có thể sàng lọc (đối với CSF) một nhóm heo giống trước khi nhập đàn với chi phí khá rẻ để phát hiện tình trạng nhiễm trùng dai dẳng bằng xét nghiệm LAMP.
Ưu điểm của LAMP là kết quả xét nghiệm nhanh, yêu cầu đào tạo tối thiểu, đầu tư vào thiết bị thấp, diện tích phòng thí nghiệm nhỏ và tổng chi phí cho mỗi mẫu thấp. Mặc dù chi phí có thể khác nhau, nhưng chi phí của LAMP thường chỉ bằng khoảng một nửa chi phí của PCR và còn giảm hơn nữa đối với các khuôn mẫu đơn giản khi bước chiết axit nucleic là không cần thiết. Các phòng thí nghiệm muốn đầu tư phát triển LAMP từ ban đầu với các chất bổ trợ tương đối rẻ và bộ mồi tự sản xuất có thể tránh được chi phí cao hơn so với bộ kit sẵn có, nhưng phải đối mặt với những chi phí liên quan đến việc phát triển, xác minh và chứng nhận.
Độ nhạy và độ đặc hiệu của LAMP tương đương với PCR và có thể cho kết quả sau 30 phút. Một số khu vực pháp lý đã phê duyệt bộ kit xét nghiệm LAMP thương mại để phát hiện ASF và Covid-19 trên người.
Những nhược điểm của phương pháp LAMP có thể bao gồm việc nó chưa được nhiều người trong giới học thuật và nghiên cứu biết đến và còn một số hoài nghi về phương pháp này. LAMP yêu cầu 6 (tối đa 8) đoạn mồi cho mỗi gen cần phát hiện, và việc tạo ra các mồi này khó hơn so với PCR thông thường, nhưng hiện có các công cụ hỗ trợ trực tuyến. Các bộ mồi khác nhau trong hỗn hợp có thể cần thiết cho các virus RNA có khả năng biến đổi cao như PRRS, nhưng điều này không làm giảm tính hữu ích của phương pháp. LAMP tạo ra một lượng lớn DNA và không nên mở các ống dương tính sau khi xét nghiệm để tránh vấy nhiễm trong phòng thí nghiệm. Các bộ khuếch đại của LAMP chưa thể giải được trình tự gen hữu dụng và phòng thí nghiệm có thể cần thực hiện PCR thông thường hoặc các phương pháp khác cho các mẫu dương tính với LAMP khi cần biết trình tự gen.
Ta có thể dễ dàng hình dung ứng dụng LAMP tại các chuồng xuất bán gia súc, điểm thu gom động vật và trong các lò mổ cũng như ở những nơi thiếu thốn thiết bị và xa xôi, nơi không sử dụng các thiết bị nhạy và đắt tiền. Khi không có cơ sở thiết bị thích hợp hoặc thậm chí không có điện và bắt buộc cần có kết quả ở 2 dạng có/không là bắt buộc đối với để người ta quyết định hành động trong thời gian thực tại chỗ, LAMP rõ ràng có thể là giải pháp phù hợp. Chi phí thấp và không yêu cầu về thiết bị đã phần nào cản trở sự phát triển của LAMP, vì các công ty và phòng thí nghiệm của trường đại học có thể thích cơ sở thiết bị đắt tiền và lợi nhuận đầu tư có thể quan trọng hơn chi phí thực tế cho các dịch vụ chăm sóc sức khỏe có thu phí.
Khi thế giới hướng tới việc kiểm soát và loại bỏ các bệnh dịch xuyên biên giới quan trọng như Dịch tả heo châu Phi (ASF), PRRS và Dịch tả heo cổ điển (CSF), sự sẵn có của một xét nghiệm nhanh chóng, thuận tiện, tiết kiệm chi phí sẽ có tiềm năng hữu ích.
“Có lẽ quá thực tế là điều điên rồ.” - Miguel de Cervantes Saavedra (1547-1616), Don Quixote.
