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ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas)
La técnica ELISA es muy utilizada para la detección cuantitativa de anticuerpos frente a patógenos en fluidos biológicos y tiene una alta especificidad y sensibilidad. Se realiza en placas de microtitulación de 96 pocillos y se basa en la interacción antígeno-anticuerpo y en una reacción dependiente de enzimas (colorimétrica, fluorescente o quimioluminiscente). Los valores de densidad óptica (OD por sus siglas en inglés) medidos mediante un espectrofotómetro pueden ser directa o indirectamente proporcionales a la concentración/cantidad de anticuerpos detectados.
Para detectar anticuerpos totales anti-virales o anti-bacterianos/micoplasmas, se utiliza un ELISA indirecto en el que se fija un antígeno del patógeno a la fase sólida (los pocillos) y se incuba la muestra para formar un complejo antígeno-anticuerpo. Posteriormente se añade un anticuerpo secundario conjugado para generar la señal de lectura. Este sistema permite evaluar muchas muestras con un solo anticuerpo secundario conjugado.
Figura 1: ELISA indirecto para la detección de anticuerpos anti-clamidia en suero.
Los ELISA competitivos y de inhibición cuantifican los anticuerpos de la muestra en función de su capacidad para interferir con un ensayo pre-titulado. En ambos ensayos, se añade la muestra a un sistema pre-titulado y se determina la actividad de unión a partir del grado de interferencia.
Por ejemplo, para detectar la respuesta humoral frente a PRRS, se utiliza la proteína N del virus para capturar todos los anticuerpos específicos frente a PRRSv en placas de 96 pocillos recubiertos de antígeno. Después se añade un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa para visualizar los anticuerpos anti-PRRSv capturados.
La respuesta inmune humoral varía entre distintos animales y los niveles de anticuerpos detectados no reflejan necesariamente la virulencia de la cepa de PRRSv. Además, los anticuerpos maternales pueden interferir, generando falsos positivos. Generalmente, los anticuerpos de ELISA permiten detectar los anticuerpos totales, que son el conjunto de células plasmáticas circulantes y células B de memoria específicas para patógenos concretos por lo que, para detectar adecuadamente la respuesta humoral de memoria, es fundamental la detección de anticuerpos neutralizantes de virus dirigidos contra epítopes inmunodominantes. La detección de anticuerpos totales mediante ELISA puede proporcionar información útil sobre la seroconversión y el efecto potenciador que suponen las vacunas y/o infecciones posteriores.
Seroneutralización del virus (SN)
El test SN permite detectar y cuantificar los anticuerpos neutralizantes específicos para un virus en una muestra de suero. Normalmente se preincuban series de diluciones a la 1/2 de la muestra sérica con una cantidad conocida de virus y después se añade a las células diana sensibles a la infección viral. Esto permite que los virus no neutralizados infecten las células y se pueda determinar cual es la mayor dilución que es capaz de neutralizar la infección vírica y la presencia de un efecto citopático.
Los ensayos SN son muy sensibles y específicos, miden el título de anticuerpos neutralizantes tras la infección o la vacunación. La cuantificación del título puede basarse en la presencia o la ausencia del efecto citopático o en la evidencia de infección viral mediante una técnica inmunoreactiva. El test SN es útil para evaluar el nivel de reactividad cruzada serológica entre los antisueros vacunales y los aislados víricos para evaluar y correlacionar la protección cruzada.
Figura 2a: seroneutralización (SN) para la detección de anticuerpos frente a herpesvirus bovino tipo 1 (BHV-1) en suero.
Figura 2b: Seroneutralización (SN) para la detección de anticuerpos frente a virus de la diarrea viral bovina (BVDv) en suero.
Test de hemaglutinación (HI)
Se trata de un test serológico para la detección de anticuerpos y se basa en el principio de que la hemaglutinina de los virus influenza, como la de otros virus, tiene un efecto hemaglutinante sobre los glóbulos rojos, por lo tanto, es el método estándar para la detección de anticuerpos anti-influenza. Esto significa que la sangre coagulará cuando se le añadan estos virus, porque los glóbulos rojos se unirán a la hemaglutinina de la superficie del virus.
Los anticuerpos específicos inducidos como respuesta inmune humoral a la infección o vacunación con el virus pueden inhibir la aglutinación al unirse a las hemaglutininas.
Si la muestra contiene anticuerpos específicos frente a la hemaglutinina, al añadir el virus de la influenza se produce una reacción antígeno/anticuerpo. Esto se evidenciará con la siguiente adición de eritrocitos: ya no se aglutinarán porque la reacción estará inhibida.
El título sérico puede utilizarse para determinar las diluciones a las que todavía se inhibe la hemaglutinación. El valor recíproco de la mayor dilución a la que todavía se inhibe la hemaglutinación proporciona el título de anticuerpos.
Figura 3: Test de la hemoaglutinación para la detección de anticuerpos anti-Brucela en suero.
Test de la inmunoperoxidasa en monocapa (IPMA)
El test IPMA es muy utilizado para la detección de anticuerpos contra virus, especialmente los que no tienen efecto citopático, como el PCV2. Los anticuerpos neutralizantes (NA) son los principales responsables de la protección y la desaparición de la infección. Como hay una correlación positiva entre los títulos de anticuerpos del IPMA y los de VNA, los títulos de IPMA pueden considerarse una medición indirecta de los NA. IPMA no es el ensayo de elección para diagnósticos de rutina, ya que depende de los cultivos celulares infectados por virus y analizar muchas muestras séricas es relativamente lento. Por estos motivos a menudo se sustituye el test IPMA por ensayos más automatizados, que tienen una lectura objetiva final, como ELISA.
