PRRS: Métodos diagnósticos

A causa de los adelantos en técnicas de laboratorio, se han comercializado múltiples métodos para diagnosticar la presencia de PRRSV en todo el mundo. Este artículo se centra en métodos de detección de antígenos y anticuerpos basándose en su uso por veterinarios de campo en EEUU.

Tests antigénicos

Aislamiento vírico

PRRSV puede crecer en un limitado número y tipo de líneas celulares, entre las que se incluyen macrófagos alveolares porcinos o clones altamente permisivos de células MA-104. Su habilidad para replicarse en diferentes líneas celulares es variable; de este modo el uso de macrófagos alveolares porcinos junto a células MA-104 mejora la sensibilidad de los aislamientos víricos de PRRSV.

Mientras que el suero, la capa leucocitaria, los pulmones, los lavados alveolares, los ganglios linfáticos y las tonsilas son las muestras de elección para el aislamiento vírico, la eficacia de la detección en semen mediante cultivos celulares se ve limitada por la citotoxicidad del semen.

La presencia de PRRSV en cultivos celulares se confirma por la observación de efectos citopáticos (ECP). Los ECP se suelen observar entre los 2 y los 6 días.

Debido a que el aislamiento vírico requiere la presencia de virus viable, la sensibilidad de la prueba puede estar afectada por el proceso de toma de muestras, incluyendo la temperatura a la que son conservadas y el intervalo transcurrido desde la recogida.

La toma de muestras sanguíneas es un medio efectivo para investigar los patrones de transmisión de PRRSV en poblaciones porcinas.

Las camadas de cerdos infectados proporcionan muestras excelentes para la identificación de PRRSV

PCR

La PCR es un método enzimático in vitro que permite la amplificación exponencial de una secuencia específica de ácidos nucleicos mediante ciclos repetidos a diferentes temperaturas.

La transcripción reversa-PCR (RT-PCR) se ha utilizado para detectar ARN de PRRSV de diversas muestras incluyendo suero, tejidos y semen. Se considera un método muy sensible y rápido para la detección de PRRSV, ya que proporciona resultados en 24-48 h. El uso de PCR ha mejorado la detección de PRRSV en semen de verracos.

La RT-PCR anidada se ha descrito como una técnica extremadamente sensible para la detección de bajas concentraciones de PRRSV en semen de verracos. El número mínimo de viriones de PRRS por unidad de volumen detectados por RT-PCR anidada es de 10^-30 partículas infecciosas/ml, mientras que la concentración de PRRSV por unidad de volumen era de 10^-2 a 10² TCID₅₀/ml. Pese a un alto grado de sensibilidad y especificidad, el aumento de falsos positivos debido a la contaminación de los amplicones es la principal desventaja de la RT-PCR anidada.

En EEUU, hay un acuerdo general sobre las bondades del uso de TaqmanTM PCR para detectar ARN de PRRSV. La sensibilidad de TaqmanTM PCR se ha descrito como similar a la de la RT-PCR anidada (10^-2 a 10^-1 TCID50/ml). El uso de TaqmanTM PCR elimina la necesidad de analizar los productos de la PCR en gel de agarosa, ya que las muestras se leen automáticamente por un sensor fluorescente, utilizando un sistema de tubo cerrado, lo que previene de contaminaciones. Esto aumenta la velocidad y rendimiento.

Secuenciación del ADN

Los avances recientes en diagnóstico molecular permiten la caracterización de regiones de ORF (marco abierto de lectura) 5 mediante secuenciación molecular. El ORF 5 codifica para la proteína de envuelta vírica, es la porción más variable del genoma vírico y muta con frecuencia. Esto lo convierte en una herramienta útil para la caracterización genética de distintos aislados de PRRSV. Cuanto mayor es el porcentaje de homologías entre aislados, se considera que están más próximos genéticamente. La secuenciación permite a los veterinarios llevar a cabo investigaciones epidemiológicas en brotes de PRRS así como comprender mejor la epidemiología de PRRS en granjas infectadas crónicamente que tienen un historial de fallo reproductivo recurrente secundario a PRRS.

Tests de anticuerpos

Los anticuerpos de PRRSV pueden detectarse mediante ELISA y tests serológicos, incluyendo IPMA, IFA y tests de seroneutralización. Sin embargo, en EEUU, el más utilizado en porcino es el ELISA.

En estos momentos, el uso de IDEXX ELISA en el diagnóstico de la presencia de anticuerpos de PRRSV tras la infección de PRRSV se ha extendido a muchos países, incluyendo EEUU, Canadá, Asia y Latinoamérica. El IDEXX ELISA ha demostrado tener altos niveles de sensibilidad (100 %) y de especificidad (99,5 %) y la automatización permite tener resultados de muestras grandes en 24 h. Como sucede con los tests de alta sensibilidad, IDEXX ELISA puede producir falsos positivos en condiciones de campo, por lo que es importante indicar que debe aplicarse más a la detección de anticuerpos a nivel de explotación, que a la detección individual.

La presencia de anticuerpos de PRRSV por IDEXX ELISA se determina midiendo el ratio s/p (muestra de suero/control positivo). Una s/p de 0,4 ó mayor, se considera positiva a infección por PRRSV. ELISA detecta los anticuerpos (IgG) contra PRRSV a partir de los 7-14 días post-infección, alcanzando el máximo entre los 30-50 días. A partir de entonces los títulos declinan hasta llegar a niveles indetectables en el 4-6º mes post-infección.

La vacunación frente a PRRSV, edad y prevalencia regional deben ser consideradas al interpretar los resultados serológicos debido a que ni ELISA ni los otros tests serológicos distinguen los anticuerpos de a PRRSV entre los cerdos vacunados y los infectados. Además, los lechones pueden tener anticuerpos pasivos de sus madres hasta la 3-4ª semana de edad. Finalmente, los anticuerpos de PRRSV detectados por ELISA sólo son indicativos de la exposición al virus, no de que exista protección frente a PRRS.