La inmunidad inducida por Lawsonia (I)

La información disponible sobre la respuesta inmunitaria desplegada ante la aparición de Lawsonia o los factores que definen una respuesta inmunitaria protectora es mínima. En estos momentos, nuestros conocimientos se basan fundamentalmente en los análisis de las respuestas serológicas, algunos estudios iniciales sobre la inmunidad celular, estudios de protección inmunitaria materna y ensayos de eficacia de vacunas.

Inmunidad humoral

La respuesta de los anticuerpos séricos a la infección ha sido determinada en varios laboratorios mediante métodos diversos. En un estudio serológico realizado con bacterias obtenidas de tejido infectado y ELISA, se llegó a la conclusión de que la respuesta inmunitaria serológica se basaba fundamentalmente en las IgM y era de corta duración. Posteriormente, un ensayo realizado con un cultivo puro de enterocitos de ratón infectados con Lawsonia y una técnica de inmunofluorescencia para detectar y cuantificar la respuesta IgG tras la exposición a Lawsonia, situó el inicio de la respuesta IgG a los 14 días, aunque en el 80 % de los animales expuestos no se observó una respuesta inmunitaria detectable hasta que transcurrieron 21 días. Los investigadores del estudio señalaron que la detección serológica no se correlacionaba con el desarrollo de las lesiones (los animales podían ser seropositivos y no presentar lesiones macroscópicas). Finalmente, una evaluación diagnóstica con un ensayo de inmunoperoxidasa en monocapa (IPM) realizado con enterocitos de rata infectados con Lawsonia confirmó asimismo la validez de esta técnica para la detección diagnóstica en explotaciones porcinas. El ensayo de IPM permitió definir el perfil serológico de los cerdos expuestos a la vacuna comercial de Lawsonia así como el perfil correspondiente a la exposición virulenta natural (figura 1). Aunque no se ha estudiado con detenimiento, en general se cree que los niveles sistémicos de anticuerpos comienzan a declinar 4-8 semanas después de una única exposición y no parecen perpetuarse de por vida sin una reexposición o potenciación posterior.

La información disponible sobre la inmunidad mucosal es escasa pero es posible que las IgA de las secreciones puedan participar en el bloqueo de la unión del patógeno y la posterior entrada de éste en la célula. Un laboratorio ha descrito la presencia de IgA en lavados intestinales de cerdos 22 días después de la exposición a cepas virulentas de Lawsonia (Gebhart, comunicación personal). Este campo requiere una investigación extensa en los aspectos de la estimulación de las IgA y su papel en la protección y control de la infección.

La relevancia de una respuesta serológica sistémica es una cuestión pendiente de dilucidar, pero en estos momentos no existen datos que avalen su validez como un indicador satisfactorio de la inmunidad o de la eficacia de la vacuna. No obstante, el seguimiento de la serología puede tener algunas implicaciones prácticas, como:

- El uso de la serología a nivel colectivo puede constituir un instrumento especialmente valioso para determinar la exposición a Lawsonia dentro de una piara. Una vez definido el perfil colectivo y el tiempo máximo de seroconversión, puede pronosticarse que el momento de la exposición a Lawsonia se produjo como mínimo 2-4 semanas antes de la aparición de la seroconversión.

- Conocer el momento de exposición a Lawsonia ayudará a centrar los esfuerzos de mejora de las técnicas de gestión y a emplazar adecuadamente las estrategias intervencionistas como vacunas y antibióticos.

- Las vacunas para Lawsonia disponibles en la actualidad no estimulan niveles elevados de anticuerpos sistémicos, manteniendo pese a ello una eficacia probada tras la exposición al patógeno virulento.

- Es importante recordar que la presencia de antibióticos puede repercutir de forma significativa sobre el desarrollo de una respuesta inmunitaria humoral frente a Lawsonia. Algunos indicios sugieren que la exposición a Lawsonia en presencia de antibióticos puede evitar, reducir, o demorar la respuesta humoral. Este es sin duda un aspecto importante a tener en cuenta a la hora de utilizar la serología para caracterizar una piara e implantar una estrategia de control.

- Los anticuerpos IgG específicos contra Lawsonia parecen reducirse rápidamente (a las 4-8 semanas) después de una afección leve-moderada (adenomatosis intestinal porcina) pero podrían ser más elevados y persistir después de un cuadro agudo (enteropatía proliferativa hemorrágica). (Figura 1)

Fig. 1. Seroconversión producida por la administración de las vacunas de Lawsonia o la exposición a cepas virulentas determinada mediante el ensayo de IPM (Guedes et al., 2003)

Inmunidad celular

Fig. 2. Niveles de infección de Lawsonia en ratones normales () y en ratones con deficiencia de interferón gamma () (Smith et al., 2000)

La información relativa a la respuesta inmunitaria celular asociada a la exposición a Lawsonia es relativamente escasa. Lawsonia es un patógeno intracelular estricto, y por tanto parece evidente que la respuesta celular es crucial, sino imprescindible, para garantizar una inmunidad protectora consistente. El interferón gamma es a menudo un componente esencial del sistema inmunitario para el control de las bacterias patógenas intracelulares y los virus. Para evaluar su participación en el control de Lawsonia, se inoculó una cepa natural de L. intracellularis en una estirpe de ratones normales y en una estirpe con deficiencia de interferón gamma. Los resultados del estudio indican que los ratones normales manifestaban en su mayoría la infección por Lawsonia 21 días después de la exposición, pero que a partir de entonces las bacterias eran erradicadas y los ratones recuperaban un aspecto normal y saludable. Por el contrario, los ratones con deficiencia de interferón gamma expuestos a Lawsonia sufrieron sin excepción la infección de las criptas y el proceso infeccioso persistió hasta la conclusión del estudio (35 días). Los ratones con deficiencia de interferón gamma mostraron una mayor sensibilidad a la infección, presentaron un aumento paulatino de las criptas infectadas y sufrieron mortalidad asociada a Lawsonia (ver figura 2: cuadrados, ratones normales; círculos, ratones con deficiencia de interferón gamma). Este estudio confirma el protagonismo de la respuesta inmunitaria celular en el control de la infección por Lawsonia en ratón.

En otro estudio, Guedes et al. evaluaron el momento de inicio y la duración de la respuesta celular en el modelo porcino más relevante. Este grupo utilizó la técnica de ELISPOT para cuantificar la producción de interferón gamma en linfocitos T estimulados. El estudio comparó la producción de interferón gamma en cerdos control expuestos a una vacuna comercial y en cerdos expuestos a una cepa patógena de Lawsonia. La respuesta inmunitaria celular inicial pudo percibirse entre 9-14 días después de la exposición a la vacuna y a la cepa patógena, presentando respuestas detectables el día 28, con niveles máximos en los dos grupos expuestos entre los días 42-49. Tanto en los cerdos vacunados como en los cerdos expuestos al patógeno se observó una respuesta celular detectable hasta 13 semanas después de la exposición (figura 3) (7).

Fig. 3. Resultados del ensayo de linfocitos T con ELISPOT para la detección del interferón gamma en cerdos expuestos a Lawsonia intracellularis (Guedes et al., 2003)

En conclusión, la respuesta inmunitaria celular (valorada a través del interferón gamma) ha demostrado su relevancia en el control y la erradicación de la infección por Lawsonia intracellularis. Es necesario ampliar las investigaciones en el ámbito de la inmunidad celular y el control de Lawsonia, pero hasta la fecha puede considerarse válida la siguiente información relativa a las aplicaciones prácticas de la inmunidad celular:

- La inmunidad celular es fundamental en el control y la eliminación de las infecciones de Lawsonia.

- Tanto las cepas virulentas como las vacunas comerciales vivas atenuadas generan una respuesta inmunitaria celular significativa.

- La estimulación máxima de la respuesta inmunitaria celular no se produce hasta 42-49 días después de la exposición, un dato a tener en cuenta en los programas de control de vacunación. Es importante vacunar a los animales antes de la exposición y con la antelación suficiente para disponer de una respuesta inmunitaria máxima en el momento del inicio de la exposición al patógeno virulento.

- Las mediciones de la respuesta inmunitaria celular son difíciles de realizar y en la actualidad no se pueden conseguir fácilmente en los laboratorios de diagnóstico.

Inmunidad materna

El hecho de que la enteropatía proliferativa acontezca en una etapa avanzada del ciclo vital del cerdo, en los ejemplares de engorde, hace suponer que la inmunidad materna se haya implicada en el control de las infecciones de Lawsonia durante la lactancia. Varios laboratorios han señalado la presencia de anticuerpos específicos frente a Lawsonia en el calostro de las cerdas lactantes y en el suero de los cerdos tras el destete. El nivel de anticuerpos presente en el suero de los cerdos tras el destete se reduce rápidamente en la mayor parte de los casos, lo que avala la idea de una transferencia pasiva.

Hasta el momento se conoce muy poco sobre el papel de la inmunidad materna en la infección por Lawsonia, pero un estudio de gran tamaño finalizado recientemente ha abordado esta cuestión. En dicho estudio, las cerdas analizadas procedían de una piara sin antecedentes clínicos de Lawsonia y los análisis serológicos realizados (inmunofluorescencia) no revelaron anticuerpos específicos contra Lawsonia en ninguna de ellas. Las cerdas se dividieron en dos grupos de tratamiento distintos. El grupo A fue hiperinmunizado en tres ocasiones con una vacuna atenuada experimental con el fin de estimular la respuesta inmunitaria humoral y celular. Este protocolo de inmunización extrema se diseñó para garantizar la aparición de niveles máximos de anticuerpos maternos que facilitaran la determinación de la protección pasiva. El grupo B permaneció sin exposición a Lawsonia. Tras el parto, los lechones nacidos de estas cerdas fueron asignados aleatoriamente a varios grupos de tratamiento. El diseño del estudio se detalla en la tabla 1.

Tabla 1: Resumen del diseño del ensayo para evaluar la inmunidad materna.
Grupo	Nº lechones por grupo	Estado inmunitario materno	Tratamiento de los lechones	Vía	Día vacuna	Exp. al patógeno	Vía	Día de exp.	Día fin estudio
1	20	Hiper-inmunizado	Vacuna	Solución oral	21	Sí	IG	42	63
2	20	Hiper-inmunizado	Placebo	Solución oral	21	Sí	IG	42	63
3	10	Hiper-inmunizado	Ninguno	Ninguna	Ninguno	Ninguna	Ninguna	Ninguno	63
4	20	Negativo	Vacuna	Solución oral	21	Sí	IG	42	63
5	20	Negativo	Placebo	Solución oral	21	Sí	IG	42	63
6	10	Negativo	Ninguno	Ninguna	Ninguno	Ninguna	ND	Ninguno	63

Los grupos 3 y 6 se mantuvieron para cerciorarse de que los cerdos eran normales y sanos y asegurarse de que la infección de Lawsonia no era transmitida por la madre a los lechones durante el estudio. Mediante métodos serológicos, se comprobó que las cerdas de los grupos 1-3 eran seropositivas en el momento del parto. También se confirmó que las cerdas de los grupos 4-6 eran seronegativas en el momento del parto. En este estudio complejo se llevaron a cabo varias evaluaciones.

- Objetivo 1: evaluación de la eficacia de la vacuna en animales no expuestos al patógeno mediante la comparación de los grupos 4 y 5.

- Objetivo 2: evaluación de la protección materna a través de la transferencia pasiva comparando los grupos 2 y 5.

- Objetivo 3: evaluación de la eficacia de la vacuna frente a la inmunidad materna mediante la comparación de los grupos 1 y 4 (y 5).

El criterio principal de evaluación de la eficacia del estudio fue el examen histopatológico de las lesiones macroscópicas y microscópicas asociadas a la infección por L. intracellularis. Mediante estos parámetros y la comparación de los lechones vacunados con los lechones no vacunados de las cerdas no inmunizadas se demostró la existencia de una reducción significativa (P <0,05) de las lesiones macro y microscópicas asociadas a la infección por L. intracellularis, tanto en el íleon como en el colon (tabla 2).

Tabla 2. Eficacia de la vacuna en lechones nacidos de cerdas seronegativas.
Grupo	Estado inmunitario materno	Tratamiento de los lechones	Puntuación media lesiones macros. (íleon)	Puntuación media lesiones macros. (colon)	Puntuación media lesiones micros. (íleon)	Puntuación media lesiones micros. (colon)
4	Negativo	Vacunados	0,15e	0,05e	0,15e	0,05e
5	Negativo	No vacunados	2,35e	0,80e	2,42e	1,35e
6	Negativo	No vacunados Controles estrictos	0,00§	0,00§	0,20§	0,00§
e La diferencia surgida en la comparación de los grupos 4 y 5 resultó estadísticamente significativa (P <0,05). § Grupo no incluido en el análisis estadístico tal y como se indica en el protocolo.

Para evaluar los efectos de la inmunidad materna, los lechones nacidos de cerdas inmunizadas (grupo 2) y los lechones de las cerdas no inmunizadas (grupo 5) fueron comparados después de una exposición provocada al patógeno virulento (tabla 3). En este caso los cerdos nacidos de las hembras inmunizadas presentaron una incidencia significativamente menor (P <0,05) de lesiones macroscópicas y microscópicas en el íleon y de lesiones microscópicas en el colon. Estos datos confirman el nivel de protección significativo que la inmunidad materna puede conferir frente a la enteritis proliferativa a los lechones de las cerdas hiperinmunizadas. Debe señalarse que las cerdas del estudio fueron sometidas a una pauta de vacunación extrema para generar esta inmunidad y que la protección pasiva en los lechones se observó sólo hasta las 6 semanas de edad y cabe esperar que en condiciones reales ésta se reduzca de forma similar, lo que finalmente, en una etapa vital posterior, generaría cerdos sin protección inmunitaria y sensibles al patógeno.

Tabla 3. Medición de la inmunidad materna en lechones nacidos de cerdas inmunizadas.
Grupo	Estado inmunitario materno	Tratamiento de los lechones	Puntuación media lesiones macros. (íleon)	Puntuación media lesiones macros. (colon)	Puntuación media lesiones micros. (íleon)	Puntuación media lesiones micros. (colon)
2	Hiper-inmunizado	No vacunados	0,85d	0,45	0,70d	0,55d
5	Negativo	No vacunados	2,35d	0,80	2,42d	1,35d
6	Negativo	No vacunados Controles estrictos	0,00§	0,00§	0,20§	0,00§
d La diferencia surgida en la comparación de los grupos 2 y 5 resultó estadísticamente significativa (P <0,05). § Grupo no incluido en el análisis estadístico tal y como se indica en el protocolo.

Finalmente, los datos fueron evaluados para determinar si la vacunación, en comparación con la inmunidad materna, podía conferir una protección superior o más prolongada que la inmunidad pasiva. A fin de evaluar esta hipótesis, los grupos 1 (cerdas inmunizadas y lechones vacunados) y el grupo 2 (cerdas inmunizadas y lechones no vacunados) fueron comparados para determinar si el nivel de protección inducido era cuantificable y significativamente distinto. Los datos indican que la vacunación de los lechones redujo de forma significativa (P <0,05) las puntuaciones descritas en el íleon y confirmó que la vacunación de los lechones confiere una protección clínica adicional incluso frente a la inmunidad materna (tabla 4).

Tabla 4. Evaluación de la vacunación de lechones frente a la inmunidad materna.
Grupo	Estado inmunitario materno	Tratamiento de los lechones	Puntuación media lesiones macros. (íleon)	Puntuación media lesiones macros. (colon)	Puntuación media lesiones micros. (íleon)	Puntuación media lesiones micros. (colon)
1	Hiper-inmunizado	Vacunados	0,16b	0,26	0,35	0,15
2	Hiper-inmunizado	No vacunados	0,85b	0,45	0,70	0,55
6	Negativo	No vacunados Controles estrictos	0,00§	0,00§	0,20§	0,00§
b La diferencia surgida en la comparación de los grupos 1 y 2 resultó estadísticamente significativa (P <0,05). § Grupo no incluido en el análisis estadístico tal y como se indica en el protocolo.

Este estudio confirma de forma concluyente la presencia y la importancia de la inmunidad materna y la capacidad de esta inmunidad para ser transferida de forma pasiva de la madre a los lechones hasta las 6 semanas de edad. Este hecho podría explicar en parte la frecuente aparición de la enfermedad en animales más mayores, probablemente después del declive de la inmunidad materna. Esta reducción posiblemente tenga lugar del mismo modo en condiciones reales después de la exposición natural que en este protocolo de vacunación de las cerdas.