Guía práctica para la toma de muestras de fluidos orales

Recientes pandemias (COVID-19 en humanos y peste porcina africana en cerdos) nos han confirmado la importancia de la información poblacional para entender y guiar efectivamente nuestros esfuerzos en sanidad. Recoger dicha información poblacional en cerdos siempre ha sido problemático porque los signos clínicos son muy variables y el muestreo individual resulta costoso; sin embargo, el uso de fluidos orales nos ofrece una alternativa fácil, eficiente, y económica de hacer vigilancia epidemiológica.

Los fluidos orales son obtenidos de un cerdo o grupo de cerdos simplemente colgándoles una cuerda de algodón en el corral para que la muerdan/mastiquen para luego recuperar el fluido oral de la cuerda mojada. Más de 27 patógenos, incluyendo peste porcina africana (PPA), peste porcina clásica (PPC), fiebre aftosa, circovirus porcino (PCV), síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS), producen niveles de ácidos nucleicos y/o anticuerpos específicos detectables en fluidos orales. Hoy en día, este tipo de muestra es comúnmente usado en los Estados Unidos para monitorizar poblaciones de cerdos; como ejemplo, el laboratorio veterinario diagnóstico de la Iowa State University procesó unos 1,4 millones de muestras de fluidos orales entre el 2010 y el 2019.

Primero lo primero:

1. ¿Cuál es mi objetivo sanitario a largo plazo? ¿Cómo me ayudará la vigilancia a lograr dicho objetivo?
2. Entiende el proceso: Hay muchos videos on-line que describen cómo y por qué muestrear fluidos orales.

Muestreo de fluidos orales:

1. Organiza los materiales: Dispón de cuerdas, cortadores, bolsas, tubos, etc, para cada edificio. Mantén la bioseguridad y evita acarrear materiales de un edificio a otro.
2. Toma las muestras temprano por la mañana: Los cerdos están más activos a primera hora; toma las muestras antes de alimentarlos.
3. Usa la “psicología” porcina: La primera vez, permíteles interactuar con la cuerda colgada el tiempo suficiente para explorar y aprender el proceso (unos 45 minutos). Si los cerdos se muestran indiferentes, tira al suelo un metro de cuerda con nudos en los extremos durante unos 30 minutos. Una vez empiecen a jugar con ella, arrastra la cuerda lentamente guiando a los animales al lugar elegido y cuelga una cuerda nueva para que la mastiquen. Ten en cuenta que el uso de saborizantes o aromatizantes en la cuerda ha ofrecido un beneficio muy reducido en la práctica.
4. ¿Qué animales muestrear? Los lechones antes del destete se muestrean mediante la recogida de los fluidos orales familiares (cerdas y lechones). Se pueden recoger fluidos orales individuales o por corral de cerdos de ≥ 21 días de edad, incluidas las cerdas alojadas en grupo. Se pueden recoger fluidos orales de verracos y cerdas alojados individualmente, pero requiere entrenamiento (ver #3) y generalmente no es práctico en grandes sistemas comerciales.
5. Sigue una rutina: Cuelga la cuerda en el mismo lugar a la misma hora del día para establecer una rutina. Los cerdos aprenderán rápidamente el proceso y sabrán exactamente qué hacer en los muestreos posteriores. Una vez que se establece un patrón, el tiempo de recogida puede reducirse a 20 minutos. No dejes la cuerda en el corral durante un período prolongado de tiempo (horas) porque (a) la muestra se perderá con el tiempo a medida que la cuerda se seque; (b) los cerdos son fuertes y destruirán la cuerda si se les da suficiente tiempo; (c) los cerdos se aburren con la cuerda y simplemente la ignoran.
6. Evita el exceso de contaminación de la muestra: Coloca la cuerda para que quede a la altura del hombro de los cerdos, evitando que toque el suelo. La materia orgánica no afecta directamente a las pruebas diagnósticas (RT-PCR o ELISA), pero cuánta menos materia orgánica incluya la muestra, más fácil será para procesar en el laboratorio.
7. Usa una bolsa y un tubo limpio para cada muestra: Mete la parte húmeda de la cuerda dentro de una bolsa de plástico, escúrrela y recoge el líquido en el tubo limpio que se enviará al laboratorio (previamente etiquetado). Retira las cuerdas de los corrales después de cada muestreo para mantener la novedad (¡los cerdos también se aburren!)
8. Preserva la muestra: Enfría la muestra (4°C) poniéndola en hielo o en la nevera inmediatamente después del muestreo. Cálculos basados en datos de Prickett et al., (2010) estiman una vida media para el ARN del PRRSV en fluidos orales de aproximadamente 13 horas a 30°C, 42 horas a 20°C, y 14 días a < 10°C. Los anticuerpos frente a PRRSV no se detectaron después de 72 horas a 30°C.

Fluidos orales para programas de vigilancia:

1. ¿Cuantas muestras debo tomar y con qué frecuencia? Todos debemos ajustarnos a un presupuesto. Aun así, unas pocas muestras, de 2 a 4 cuerdas por nave (o sala), a intervalos determinados (2-4 semanas), junto con los índices productivos, nos proporcionará un relato elocuente sobre el estado sanitario de la granja (gráfica 1).
2. Prepara un plan para evaluar constantemente la información: Una buena alternativa son los diagramas de control de procesos o SPC.
3. Use el “muestreo espacial fijo” para maximizar la detección dentro del edificio: una práctica explicación de esta metodología se puede encontrar on-line
   1. Muestreo de fluidos orales (en inglés).
   2. Muestreo de fluidos orales (en castellano).
4. Espera lo inesperado: Ten un plan para verificar o descartar resultados diagnósticos inesperados. Por ejemplo: retestear por duplicado las mismas muestras, remuestrear los cerdos, analizar usando otro método, etc.
5. Recuerda la evolución natural de las enfermedades para establecer un plan. Las pruebas en base a ácidos nucleicos detectarán la presencia temprana del virus, mientras que las pruebas de anticuerpos detectarán la respuesta inmune resultante y prolongada. Ambas tecnologías funcionan mejor juntas para la monitorización, por ejemplo, para autorizar la salida de los animales en cuarentena.

Otras consideraciones:

1. Cebras y caballos… las cosas similares no son siempre iguales: Muestras que pueden parecer similares a los fluidos orales (p.e: hisopos bucales o nasales) pueden no brindar la misma tasa de detección. Ejemplos para influenza A, fiebre aftosa, Senecavirus A y PRRSV se muestran en la tabla 1.
2. No mezcles (pool) los fluidos orales y no muevas las cuerdas de un corral a otro: En lugar de mejorar la tasa de detección, estos procesos pueden crear falsos negativos.
3. Evita congelar y descongelar las muestras o los cambios bruscos de temperatura: Los anticuerpos en fluidos orales son bastante resistentes, pero los ácidos nucleicos no tanto. Divide la muestra en varias alícuotas si necesitas múltiples pruebas. En la granja, no almacenes las muestras en congeladores NoFrost, dados sus fluctuantes ciclos de descongelado automático. En el laboratorio, descongela las muestras en el refrigerador (4°C) y no a temperatura ambiente. Estas prácticas han demostrado una mejor conservación de los ácidos nucleicos (Weiser et al., 2018).

Tabla 1. Comparación de detección de ácidos nucleicos en fluidos orales versus hisopos bucales o nasales

Patógeno	Muestra	Tasa de detección (%) por día post-inoculación (DPI)
		1	2	3	4	5	6	8	10	12	15
Influenza A virusa	FO	100	100	75	25	38	29	29	17	0	0
	Hisopos	100	100	100	75	13	0	0	0	0	0
Fiebr aftosaa	FO	75	100	100	100	100	75	nd	nd	100	nd
	Hisopos	4	33	61	100	89	50	nd	nd	25	nd
Seneca VAa	FO	nd	67	nd	100	nd	100	100	100	nd	100
	Hisopos	nd	92	nd	100	nd	75	67	75	nd	8
PRRSVa	FO	0	20	60	80	100	100	100	80	100	20
	Hisopos	0	0	0	40	20	60	0	20	20	20

nd = no datos.

^aTasa de positividad (promedio) estimada para fluidos orales recogidos en corrales versus hisopo bucal o nasal. Datos tomados de Hole et al., (2019); Pepin et al., (2015); Romagosa et al., (2012); Senthilkumaran et al., (2017)