El test PCR como herramienta de diagnóstico (2/2): Usos e interpretación de los resultados

Algunos usos del test PCR:

• Detectar la presencia de ADN/ARN de un patógeno determinado – uso más común
• Serotipar un patógeno por genes específicos (ADN/ARN) que se sabe que varían entre serotipos (p.ej. genes de biosíntesis de cápsula para Actinobacillus pleuropneumoniae)
• Detectar la presencia de genes de virulencia (p.ej. genotipado de E. coli)

Es importante recordar que las PCR solo detectan la presencia de material genético específico en función de los cebadores y no indican si el organismo puede ser infeccioso o no. Cuando se analizan genes, el test solo detecta la presencia del gen pero no confirma si el organismo está expresando el factor de virulencia detectado.

En los últimos años, los laboratorios han desarrollado PCR multiplex para analizar varios patógenos o varias cepas o genes del mismo patógeno al mismo tiempo. Estas PCR multiplex son múltiples PCR que se ejecutan a la vez. Su coste es mayor que una PCR individual pero mucho menor que realizar varias PCR por separado, ya que los laboratorios tienen un ahorro considerable en cuanto equipos, personal de laboratorio y reactivos. El laboratorio usará diferentes marcadores para identificar qué resultados positivos corresponden a cada cebador. Muchas veces estas PCR multiplex resultan muy útiles, como en el genotipado de E. coli donde se pueden analizar unos 14 genes en el mismo aislado bacteriano al mismo tiempo. Otros ejemplos son el análisis simultáneo para PRRS tipo 1 y tipo 2 o para la diarrea epidémica porcina y el delta coronavirus porcino. Es fundamental tener en cuenta que el desarrollo de estas pruebas no siempre es fácil, ya que el laboratorio debe asegurarse de que no haya interferencias entre las diferentes PCR. Es decir, que las temperaturas de ciclo y los diferentes cebadores utilizados no se inhiben ni reaccionan de forma cruzada entre sí. Cada una de estas PCR multiplex debe validarse antes de usar y producir una optimización significativa del test.

Consideraciones en la interpretación de los resultados:

Uno de los mayores retos de la PCR es que, a menudo, cada laboratorio tiene un protocolo diferente para el análisis de muestras, lo que puede suponer diferencias en el proceso de extracción del ADN/ARN, en los protocolos de ciclos, así como en los cebadores utilizados. Esto puede dificultar la comparación de los resultados obtenidos en diferentes laboratorios.

Resultado negativo

• Muestra/granja realmente negativa para el patógeno
• Asegurarse de enviar las muestras adecuadas para el patógeno en cuestión. Algunos ejemplos típicos a considerar:
  • El virus de la influenza no se vuelve sistémico, por lo que no se encontrará en muestras de sangre
  • El análisis para Mycoplasma hyopneumoniae en muestras de fluidos orales rara vez proporciona un resultado positivo ya que el patógeno normalmente se une a los cilios de la parte inferior del sistema respiratorio
  • Enviar únicamente un feto de aborto por PRRS supone solo el 50% de probabilidad de ser positivo. Deben enviarse al menos 4 fetos para maximizar las probabilidades de encontrar una muestra positiva
• Muestra recogida demasiado tarde en el desarrollo de la enfermedad por lo que el patógeno ya no está presente
  • El virus de la influenza se encuentra en las secreciones nasales solo durante los primeros 3-4 días
• Incompatibilidad del cebador
  • Nueva cepa de PRRS
• Baja prevalencia en la granja y animales muestreados no infectados
  • Es necesario aumentar significativamente el número de animales muestreados
• Dilución de una muestra positiva débil debido a la agrupación de muestras o pooling
  • Agrupación de fluidos orales que habitualmente ya son muestras diluidas (analizar varios cerdos y valores de Ct altos ya esperados en muestras positivas)

Resultado positivo

• Muestra/granja realmente positiva para el patógeno
• No distingue si la muestra es infecciosa o no
• Dependiendo del patógeno, la detección de ADN/ARN no siempre confirma la enfermedad
  • El tejido pulmonar PCR positivo para Mycoplasma hyopneumoniae confirma la presencia del organismo en el tejido pero no la gravedad o la importancia clínica del patógeno. En la mayoría de granjas (excepto las granjas negativas a Mycoplasma), es necesario confirmar visualmente el porcentaje de daño pulmonar (evaluación macroscópica) para determinar la importancia clínica de los hallazgos.
  • El suero PCR positivo para circovirus porcino tipo 2 (PCV2) confirma la presencia de PCV2 pero no si el desmedro o la neumonía son atribuibles a PCV2 o si se ha producido un fallo de la vacuna. Es necesario realizar inmunohistopatología de tejido pulmonar y/o linfoide para demostrar enfermedad asociada a PCV2.
  • El test no distingue entre virus/bacteria de vacuna viva modificada e infección de campo.
    • Importante conocer el momento y tipo de vacuna utilizada
    • Es posible que se necesite información de secuenciación
• Contaminación cruzada si no se manipulan correctamente las muestras
  • Especialmente cuando se realiza agrupación de muestras. La agrupación se debe realizar bajo una campana de laboratorio.
  • Las muestras fecales recogidas del suelo pueden contaminarse con restos ambientales del patógeno
• Valores de Ct bajos se asocian con una alta concentración de virus/bacteria en la muestra y, a menudo, se pueden correlacionar con una mayor probabilidad de enfermedad clínica
  • Valores de Ct bajos de Lawsonia intracellularis en heces posiblemente están más relacionados con lesiones intestinales
    • Ct < 20 → Enteropatía proliferativa porcina
    • Ct > 30 → No se detectan lesiones intestinales

Genotipado

• El uso del genotipado por PCR se ha vuelto más común especialmente para E. coli. Proporciona información epidemiológica sobre cambios en cepas que afectan a la granja (p. ej., influenza H1N1 vs H3N2).
• A menudo los resultados del genotipado se usan para seleccionar la vacuna que se utilizará, como con E. coli (confirmación de pili).
• Es importante recordar que los resultados solo representan una única cepa y muchas veces los cerdos se infectan con múltiples cepas al mismo tiempo.
• La detección solo confirma la presencia de genes de virulencia pero no su expresión. Muchas veces basta con saber que tiene el potencial genético para expresar el gen.
• A medida que el coste y la facilidad de la secuenciación de genes sigan disminuyendo, el uso o la necesidad del genotipado por PCR disminuirá.