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Las pruebas en base a la detección de ácidos nucleicos se han convertido en la prueba de elección para detectar la presencia de patógenos en las muestras para diagnóstico. La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es un procedimiento de análisis de ácidos nucleicos muy utilizado en los laboratorios de diagnóstico e investigación. La PCR es un procedimiento que amplifica un fragmento diminuto de ADN hasta el punto de hacerlo detectable como una banda en una tira de gel o como una señal fluorescente detectable con una máquina y que puede realizarse en unas pocas horas. Para realizar una buena PCR se requiere una importante inversión en equipos, como termocicladores, un laboratorio especializado y personal formado y con experiencia.
¿Qué es el método LAMP?
LAMP (por sus siglas en inglés Loop-mediated isothermal amplification) es un método sencillo, rápido, sensible y preciso de detección y amplificación de ADN/ARN que no requiere equipos sofisticados y es relativamente barato. La reacción se realiza en un tubo de microcentrifugación. El equipo necesario para el método LAMP es simple: una pipeta, puntas de pipetas desechable y un baño seco digital. Un baño maria o una incubadora común, o incluso termos con agua caliente, pueden ser suficientes como fuente de calor, pero para facilitar la higiene del laboratorio es muy aconsejable un termobloque digital (Figura 1).
Figura 1. Baño seco digital para tubos de microcentrífuga - apto para LAMP. Fuente: Thermo Fisher Scientific Inc.
En una aplicación típica de LAMP, la mezcla del tubo del test contendrá:
- Seis fragmentos de ADN llamados cebadores o primers que coinciden con la secuencia de ADN que se va a detectar.
- Enzima polimerasa específica (por ejemplo, BST ADN polimerasa)
- Buffers
- Reactivos de apoyo
- Un colorante indicador (indicador de pH, o colorante directo de ADN)
- Transcriptasa inversa para virus ARN
- La muestra a analizar.
Esta mezcla se incuba a 60-65°C durante 30 minutos. Si en la muestra hay ADN que coincide con los primers, se forman una serie de bucles de ADN. Los bucles se hacen más complejos y numerosos a medida que avanza la reacción de amplificación (Figura 2). Figura 2. Formación de bucles de ADN en la reacción de la polimerasa en el método LAMP. Fuente: Alhassan et al. 2015.
La amplificación de la polimerasa como subproducto produce pirofosfato de magnesio que causa turbidez (opacidad) en el tubo. Los colorantes indicadores que se unen directamente al ADN dan una señal fluorescente de espectro visible o UV. Un sistema LAMP que utiliza un indicador de pH rojo fenol cambia de rojo rosado a amarillo.
La figura 3 muestra el resultado de un ensayo LAMP para peste porcina africana (PPA) - El tubo A contenía extracto procedente del bazo de una cerda muerta por PPA. El alto contenido de ADN vírico genera un color amarillo opaco. El tubo B era un hisopo de fluido oral de la misma cerda, con la esperable menor carga viral. La turbidez en los tubos A y B es evidente al observar la línea de fondo.los tubos de la C a la F son tubos sospechosos y negativos.
Figura 3. Tubos de microcentrífuga de una prueba in situ del método LAMP en un caso de PPA. A: bazo de cerda muerta, B: fluidos orales de la misma cerda (A) , C-F: fluidos orales sospechosos y negativos.
Existen algunas variaciones de la reacción LAMP en función de la tecnología disponible. La prueba puede aplicarse en microplacas de 96 pocillos selladas con colorantes colorimétricos o fluorescentes o medidas de turbidez para obtener un resultado cuantitativo y automatizado. Fotocélulas filtradas en el bloque térmico y un LED adecuado también podrían automatizar la lectura fluorescente semicuantitativa en tiempo real de los tubos de microcentrífuga. La espectrofotometría mediante la cámara del teléfono móvil podría resolver dudas respecto a los tubos sospechosos en aquellos casos en los que el ojo humano no pueden resolver el dilema.
La reacción LAMP se puede realizar en el campo, in situ, para una práctica obtención de resultados en el "Point-of-Care" con una espera mínima. Nuestro laboratorio construyó y verificó ensayos LAMP económicos (desde "cero" y a partir de kits) para peste porcina clásica (PPC), circovirus porcino 2 (PCV2) y peste porcina africana (como en el caso anterior). Buscabamos validar la idea (para PPC) de que se podía examinar un lote de reproductores antes de su introducción, de forma económica, para detectar una infección persistente mediante el método LAMP.
Las ventajas del método LAMP son la rapidez de los resultados, la mínima formación necesaria, la escasa inversión en equipos, el reducido espacio que ocupa en el laboratorio y el bajo coste global por muestra. Aunque los costes pueden variar, el coste del método LAMP es aproximadamente la mitad del coste de la PCR y se reduce aún más para matrices simples donde es no es necesario realizar una extracción previa del ácido nucleico . Los laboratorios que quieran invertir en el desarrollo del método LAMP desde cero con reactivos relativamente baratos y conjuntos de primers de creación propia pueden evitar el coste más elevado de un kit listo para su uso, pero deben hacer frente a los costes asociados al desarrollo, la verificación y la certificación.
La sensibilidad y especificidad del método LAMP es comparable a la de la PCR y puede dar resultados en 30 minutos. Algunas administraciones han aprobado kits comerciales de pruebas LAMP para la PPA y el Covid-19.
Entre las desventajas del método LAMP se incluye el desconocimiento por parte de algunos académicos e investigadores y cierto escepticismo sobre el método. LAMP requiere 6 (hasta 8) primers para cada gen a detectar y la generación de primers es más difícil que la PCR convencional, pero existen herramientas onlíne. En el caso de los virus de ARN altamente mutables, como el PRRS, pueden ser necesarios varios conjuntos de primers en la mezcla, pero esto no ha impedido su uso. El método LAMP genera mucho ADN y, por lo general, los tubos positivos no deben abrirse después de la prueba para evitar la contaminación del laboratorio. Los amplicones de LAMP no son susceptibles fácilmente a una secuenciación útil y el laboratorio puede tener que recurrir a una PCR convencional u otros métodos para las muestras positivas al método LAMP cuando se requiera obtener la secuencia del virus.
Es fácil imaginar la aplicación del método LAMP en puntos de venta de ganado, de recogida de animales y mataderos, así como en entornos más rudimentarios y remotos donde no es posible trasladar equipos sensibles y caros. Cuando no se dispone de instalaciones sofisticadas o incluso de electricidad y las respuestas binarias sí/no son imprescindibles para la toma de decisiones en tiempo real y sobre el terreno, LAMP podría facilitar un camino a seguir. Debido al bajo coste y el no necesitar equipos podría haber dificultado en cierta medida la proliferación de LAMP, ya que algunas empresas y laboratorios universitarios pueden llegar a preferir instalaciones más costosas, dandole mayor importancia al rendimiento marginal de la inversión que al costo real de los servicios de analisis veterinarios en base a tarifa.
A medida que el mundo avanza hacia el control y la erradicación de importantes enfermedades endémicas transfronterizas como la peste porcina africana (PPA), el síndrome respiratorio porcino (PRRS) y la peste porcina clásica (PPC), la disponibilidad de una prueba rápida, cómoda y asequible tiene un gran potencial de uso.
"Tal vez ser demasiado práctico es una locura” - Miguel de Cervantes Saavedra (1547-1616), Don Quijote.
