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Durante estos últimos años, se han desarrollado y validado nuevas herramientas de muestreo, monitoreo, y diagnóstico en porcino que resulten más rápidas, sencillas y menos costosas.
Una de estas técnicas es la toma y el uso de fluidos orales (saliva) como espécimen para diagnóstico en porcino. Esta técnica ya ha sido validada experimentalmente para PRRSV, PCV2 e influenza, y se está utilizando de forma rutinaria en los sistemas productivos de EEUU para la detección de PRRSV e influenza a nivel de población. Brevemente, la técnica se basa en suspender una cuerda de algodón en un corral para que los cerdos la muerdan mientras depositan su saliva en ella (Prickett et al. 2008).
1. Toma de muestras:
Materiales necesarios: Cuerda de algodón 100% (no tratada con productos químicos), tijeras, bolsas de plástico (tipo Zipplog ®) y tubos de plástico estériles con base cónica o redondeada y con capacidad suficiente para el volumen de la muestra (5cc, 10cc, o 20cc).
Puntos clave:
- El número de cuerdas necesario para que el muestreo sea representativo dependerá del tamaño de la población, de la distribución de las naves, y del tamaño de los corrales (se considera que en naves de una sola planta de 1000 animales, 6 cuerdas son suficientes para detectar el 10% de prevalencia con un 95% de confianza (Detmer et al., 2010).
- El diámetro de la cuerda y la altura a que debe situarse dependerá de la edad de los animales, pero debe ser de fácil acceso para todo el grupo.
- Un periodo de tiempo de 30 min es suficiente para que el 75% de los animales contacten con la cuerda en un corral de 25-30 animales, aumentando hasta el 90% si durante el mismo tiempo, suspendemos dos cuerdas.
- Antes de la recogida, comprobar que la cuerda está saturada de saliva (ayudará a determinar si el tiempo ha sido suficiente).
2. Recogida de la muestra:
Se corta la parte húmeda de la cuerda y se deposita en la bolsa de plástico limpia. Se procede a extraer la saliva como muestran las imágenes y la muestra se decanta en los tubos estériles.
Precauciones: La extracción de la saliva debe realizarse en la mayor brevedad posible después de recoger las cuerdas y procurando manipular lo menos posible la cuerda directamente con las manos para evitar contaminaciones cruzadas. Refrigerar las muestras rápidamente.
3. Conservación:
- La suciedad de las muestras (artefactos) puede interferir en el resultado del diagnóstico. Por ello la saliva tiene que ser centrifugada (1000-2000 rpm/30 min.) o al menos, permitir durante 60 min. que las partículas de suciedad presentes en la muestra se depositen en el fondo del tubo. Con el sobrenadante, proceder a su análisis o conservación.
- Las muestras deben ser mantenidas en refrigeración (4-10°C). A 4°C se pueden tener hasta 12 días sin que por ello se vea alterada la detección de PRRSV mediante PCR. Para su conservación las muestras deben ser congeladas (-20°C o -80°C).
4. Análisis:
La detección de patógenos virales y bacterianos se realiza mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). El RNA viral de PRRS e influenza pueden ser detectados en saliva a las 24 h. PI. La detección de anticuerpos frente a PRRSV y PCV2 se puede realizar mediante el test de ELISA y supone una alternativa al PCR para disminuir costes de diagnóstico. Sin embargo, el aislamiento vírico de PRRSV y PCV2 aún no se realiza y en el caso de influenza, el porcentaje de aislamiento a partir de fluidos orales PCR positivos es del 51%.
5. Ventajas y limitaciones de la técnica:
El monitoreo de una población mediante fluidos orales puede resultar en un menor coste en diagnostico mientras se incrementa el número de cerdos muestreados, y en un futuro, los patógenos que pueden ser detectados.
La toma de las muestras no requiere personal especializado y además la naturaleza curiosa de los cerdos facilita el muestreo, al interactuar y jugar con la cuerda mientras depositan la saliva en ella.
Con las muestras de fluidos orales conseguimos una mayor representatividad de la población y la sensibilidad para detectar infecciones de baja prevalencia (≤10%) es igual o superior a las tradicionales 30 muestras individuales.
Las muestras de fluidos orales son representativas a nivel de población, pero nunca pueden sustituir las muestras individuales para el aislamiento de un microorganismo.
Es muy importante para evitar falsos negativos el evitar hacer pools de las muestras y la verificación de que las muestras son procesadas en un laboratorio familiarizado con las técnicas de diagnostico en saliva.
Para más información consultar:
http://vetmed.iastate.edu/vdpam/disease-topics/oral-fluids
http://www.vdl.umn.edu/guidelines/oralfluids/home.html
