Diagnóstico laboratorial: virus de la influenza tipo A (IAV)

Test disponibles:

Puede ser beneficioso revisar el excelente resumen proporcionado en el artículo sobre la influenza de Phil Gauger:

Patología macroscópica

• Evalúa la presencia de lesiones en tejidos que pueden sugerir la presencia de enfermedad.
• Ubicación de las lesiones:
  • Consolidación craneoventral (especialmente en los lóbulos apical y cardíaco)

• La presentación puede ser difusa cubriendo múltiples áreas del pulmón.
• Puede haber edema interlobular.

• Pros:
  • La gravedad de las lesiones puede relacionarse con la importancia clínica
• Contras:
  • Lesiones macroscópicas no diagnósticas (muy similares a Mycoplasma hyopneumoniae)
  • A menudo existen infecciones secundarias o coinfecciones

Histopatología

• Evalúa la presencia de lesiones que pueden confirmar la presencia de enfermedad.
• Tipo de muestra: tejido pulmonar.
• Pros:
  • La bronquiolitis necrotizante suele considerarse patognomónica de la infección por el virus de la influenza A en cerdos

    

  • Las lesiones características aparecen unos días después de la eliminación del virus en el cerdo, especialmente cuando hay coinfecciones
• Contras:
  • Solo evalúa una pequeña cantidad de tejido
  • Las lesiones no complicadas pueden resolverse rápidamente (5-7 días)

Inmunohistoquímica (IHC)

• Detecta la presencia de antígeno viral.
• Tipo de muestra: tejido pulmonar.
• Pros:
  • Detecta el virus en el lugar de la lesión (buena prueba de causalidad)
  • El antígeno diana suele ser una nucleoproteína que se conserva en todos los virus de la influenza A
• Contras:
  • Solo evalúa una pequeña cantidad de tejido
  • El virus solo está presente por un corto período de tiempo (pocos días)
  • Requiere que haya una cantidad de virus significativamente mayor que la PCR

Aislamiento del virus

• Aísla el virus vivo.
• Tipos de muestras: tejido pulmonar, lavado broncoalveolar, hisopos nasales.
• Pros:
  • Criterio de referencia.
  • Aislamiento del virus para utilizarlo en el desarrollo de vacunas (vacunas autógenas) o pruebas serológicas (inhibición de la hemaglutinación) para determinar la protección cruzada
• Contras:
  • Caro
  • Resultados lentos
  • Requiere huevos de gallina embrionados o células de riñón canino Madin-Darby (MDCK)
  • El proceso de inoculación es muy laborioso
  • A menudo difícil de cultivar (muchos falsos negativos)
  • La manipulación de las muestras desde el campo hasta el laboratorio puede afectar a la supervivencia del virus

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

• Detecta la presencia de una secuencia específica de ácido nucleico viral (ARN)
• Tipos de muestras: hisopos nasales, fluidos orales, tejido pulmonar, lavado broncoalveolar.
• Pros:
  • Los primers (cebadores) pueden diseñarse para:
    • Detección de todos los subtipos de virus de la influenza A - dirigido a la nucleoproteína conservada
    • Detección de grupos de virus de subtipos específicos: subtipo H1, H3, N1 o N2
  • Alta sensibilidad
  • Detección temprana
  • La cuantificación por PCR se asocia con la presencia de lesiones
  • Coste moderado
    • A menudo se pueden combinar muestras de hisopos o tejidos para reducir el coste y minimizar la pérdida de sensibilidad (especialmente en lo que respecta a la relevancia clínica)
• Contras:
  • Alta sensibilidad – especialmente en fluidos orales puede detectar la presencia de pequeñas cantidades de virus en la granja, lo que dificulta la interpretación clínica de los resultados con respecto a la extensión o la gravedad de la enfermedad.
  • El virus sólo está presente en el huésped durante unos días (3- 5 días especialmente en los hisopos nasales)
  • No se pueden utilizar muestras de sangre o suero para la prueba PCR, ya que el virus permanece en el pulmón y no es sistémico.

Secuenciación genética

• Secuencia segmentos genéticos del ácido nucleico (ARN) del virus.
• Tipos de muestras: tejido pulmonar, hisopos nasales, lavado broncoalveolar, fluidos orales.
• Pros:
  • Permite diferenciar entre subtipos en muchos niveles diferentes de clados
    • H1: se divide en clados que suelen denominarse con el alfabeto griego (alfa, beta, gamma, etc.)
    • H3: se divide en clústers que suelen denominarse con números romanos (I, IV, etc.)
    • Muchos de estos clados o clústers relevantes se describen aquí.
  • Puede ayudar a diferenciar la introducción de nuevos virus respecto a virus existentes o del pasado.
  • Puede ayudar a seleccionar la cepas vacunales en función del subtipo/clado
• Contras:
  • Caro
  • Normalmente sólo se secuencia el gen HA
  • La variabilidad entre subtipos/clados sigue creciendo y se está volviendo más compleja

Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)

• Detecta la presencia de anticuerpos.
• Tipo de muestra: suero.
• Pros:
  • Las pruebas ELISA pueden diseñarse para:
    • Detección de anticuerpos de todos los subtipos - dirigido a la nucleoproteína conservada
    • Detección de anticuerpos específicos de subtipo – dirigido a las proteínas específicas hemaglutinina (denominada H o HA) y/o neuraminidasa (denominada N o NA)
  • Los animales permanecen positivos durante varias semanas (empiezan a disminuir después de 8-10 semanas)
  • Puede utilizarse en casos crónicos
• Contras:
  • Los anticuerpos específicos y el momento de la detección pueden variar ligeramente entre los distintos kits comerciales disponibles
  • Los animales tardan entre 10 y 14 días en volverse seropositivos
  • No distingue entre vacunación e infección por virus campo
  • No identifica un subtipo específico de virus

Inhibición de la hemaglutinación (HI)

• Detecta la presencia de anticuerpos.
• Tipo de muestra: suero.
• Pros:
  • Los animales permanecen positivos durante varias semanas
  • Puede utilizarse en casos crónicos
  • Puede utilizarse para determinar el momento adecuado para la vacunación evitando la interferencia de anticuerpos maternales
  • Puede utilizarse para determinar la protección cruzada entre cepas
• Contras:
  • Cada prueba es específica de la cepa
  • Requiere el aislamiento de la cepa específica para evaluar la protección cruzada
  • Los animales tardan entre 10 y 14 días en volverse seropositivos
  • No distingue entre vacunación e infección por virus campo

Interpretación de resultados:

Patología macroscópica

• Positivo: Confirmación de la presencia de neumonía.
• Negativo: Los casos tempranos pueden no manifestar lesiones pulmonares extensas.

Histopatología

• Positivo: Confirmación de la enfermedad.
• Negativo: Negativo o las lesiones no se detectan si se analiza una muestra incorrecta o se realiza mucho después de la infección.

IHC

• Positivo: El virus está presente en el sitio de la lesión.
• Negativo: Negativo o el virus no se detecta si la prueba se realiza mucho después de la infección o la concentración de virus es demasiado baja (sólo está presente por un corto período de tiempo).

Aislamiento del virus

• Positivo: Confirmación de la enfermedad.
• Negativo: El virus no se detecta si la prueba se realiza mucho después de la infección o simplemente no puede crecer debido a otra contaminación o una mala manipulación (presente pero muy difícil de cultivar).

PCR

• Positivo: Confirmación de la enfermedad.
• Negativo: Negativo, el virus no se detecta si la prueba se realiza mucho después de la infección o por una selección o manipulación incorrecta de la muestra.
• No concluyente: Muy poco virus presente o coinfección con más de un subtipo.

Secuenciación genética

• Permite identificar el subtipo y clado del virus.
• Permite ajustar la cepa vacunal para una mejor protección.

ELISA

• Positivo: Anticuerpos maternales o exposición anterior (> 2 semanas) a vacuna o virus campo.
• Negativo:
  • Negativo a vacuna o virus campo
  • Infección demasiado reciente para ser detectada (10-14 días para la seroconversión)
  • Incompatibilidad entre la prueba y el virus (subtipo o clado)

HI

• Positivo: Anticuerpos maternales o exposición anterior (> 2 semanas) a vacuna o virus campo.
• Negativo:
  • Negativo a vacuna o virus campo
  • Infección demasiado reciente para ser detectada (10-14 días para la seroconversión)
  • Incompatibilidad (subtipo o clado) entre el virus utilizado en la prueba y el virus que infecta al cerdo

Escenarios:

Cerdos de engorde con estornudos y signos respiratorios (agudos o crónicos):

• Recoge 2-4 muestras de fluidos orales del grupo y analízalas mediante PCR.
• Recoge 12 hisopos nasales de cerdos infectados con signos clínicos (tienen secreción nasal clara), haz 3 pools de 4 muestras cada uno y analízalos mediante PCR.
• Secuencia una muestra PCR positiva para determinar mejor el clúster/clado.

Determinación del momento de exposición y posible necesidad de vacunación:

• Recoge muestras de 10-15 cerdos a las 3, 6, 9 y 12 semanas de edad.
• Dos enfoques para la recogida:
  • Transversal – recoge de diferentes grupos de edad a la vez (se obtienen resultados más rápido).
  • Longitudinal – recoge de los mismos cerdos a lo largo del tiempo (se obtienen resultados más precisos).
• Análisis de muestras de suero mediante ELISA.
• Recoge 2-4 muestras de fluidos orales del grupo y analízalas mediante PCR.
• Secuencia una muestra PCR positiva de cada grupo de edad para determinar mejor el clúster/clado.