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Lawsonia intracellularis no puede aislarse o mantenerse con facilidad en cultivos celulares. Así, el diagnóstico se limita a la detección de la bacteria mediante tinción de plata, o más específicamente, con anticuerpos policlonales o monoclonales específicos marcados con peroxidasa o isotiocianato de fluoresceína (FITC). No obstante, estos métodos sólo se utilizan en muestras obtenidas post mortem. La detección del ADN genómico de Lawsonia intracellularis mediante una o dos reacciones en cadena de la polimerasa (PCR o PCR anidada) ha demostrado una gran especificidad y sensibilidad. Este método puede aplicarse tanto a muestras de necropsia como fecales. Lawsonia intracellularis no se excreta de forma uniforme en las heces. Normalmente puede detectarse poco después de la infección, antes de la seroconversión. Posteriormente se encuentra de forma menos frecuente e intermitente. Las muestras fecales (1-2 g ó 1-2 hisopos fecales) pueden tomarse directamente de los animales. La agrupación de las muestras para la PCR reduce los costes pero disminuye la sensibilidad del ensayo.
Análisis por PCR de las heces porcinas para la detección de Lawsonia intracellularis
Tabla 1: Ventajas e inconvenientes de los ensayos serológicos de Lawsonia intracellularis.
| IF / IPM | ELISA de competición | |
| Ventajas | • Es posible valorar los niveles de anticuerpos • La reacción se correlaciona con la morfología del patógeno |
• Alta especificidad • Alta sensibilidad • Proceso estandarizado • Excelente validación in situ • Alta reproducibilidad • Alta repetibilidad • Posibilidad de automatización • Alto rendimiento • Evaluación objetiva • Hojas de datos informatizadas |
| Inconvenientes | • Tinción inespecífica (IF > IPM) • Baja reproducibilidad • Baja repetibilidad • Evaluación muy subjetiva • Tiempo de ejecución prolongado |
• Semicuantitativo |
Existen varios ensayos de PCR específicos y válidos elaborados con pares de cebadores extraídos de varias porciones de la secuencia del ADN de Lawsonia intracellularis porcina. El uso de la PCR en muestras fecales requiere un protocolo cuidadoso en los métodos de extracción para que el ADN de la bacteria, libre de sustancias inhibidoras, pueda utilizarse como ADN molde para la PCR. La PCR permite determinar si el cerdo sufre en ese momento una infección activa, una ventaja notable, pero adolece de un coste elevado y de una sensibilidad baja en el marco de la enfermedad subclínica y crónica.
Figura 9: PCR anidada para la detección de Lawsonia intracellularis:
 Foto: J. Pohlenz |
Bandas 1 y 8: Marcador de peso molecular. Banda 2: ADN control negativo de L. intracellularis. Banda 3: Control positivo específico de L. intracellularis (270 pb). Banda 4: ADN de muestra fecal, negativo para L. intracellularis. Banda 5: íleon porcino, negativo para L. intracellularis. Banda 6: muestra fecal de ADN, positivo para L. intracellularis. Banda 7: íleon porcino, positivo para L. intracellularis. |
El ADN se extrae de las muestras de heces o de tejido orgánico. Los equipos comerciales disponibles para la preparación del ADN mejoran habitualmente la calidad y la reproducibilidad de la extracción del material genómico. El ADN, una vez extraído, puede almacenarse a -20ºC antes de su procesado. Se emplean series de cebadores específicos para Lawsonia intracellularis con el objetivo de amplificar los fragmentos de genoma que pueden visualizarse en la PCR en tiempo real mediante cebadores de detección marcados, o bien en una electroforesis de gel de agarosa mediante tinción del ADN (p. ej. bromuro de etidio) (fig. 9).
La contaminación del material de diagnóstico durante el muestreo, el transporte y el procesado, así como la contaminación cruzada durante la amplificación, pueden dar lugar a falsos positivos. El riesgo de contaminación cruzada aumenta en la PCR anidada, que es 100-1000 veces más sensible que la PCR tradicional. La PCR sólo debe realizarse en laboratorios que tengan experiencia con este método y puedan procesar un gran número de muestras para diagnóstico biológico molecular y dispongan del equipo especial necesario: centrífugas para la preparación del ADN, termobloques y termocicladores para la realización de la PCR, etc. Se recomienda encarecidamente el uso de zonas de procesamiento separadas y aisladas convenientemente para llevar a cabo las diferentes etapas de la PCR o el uso de equipo a prueba de contaminación cruzada, sobre todo en el caso de la PCR anidada.
Detección de Lawsonia intracellularis: los productos específicos de la PCR en la PCR en tiempo real o los fragmentos de un tamaño estimado como apropiado visibles en la electroforesis en gel se consideran positivos. Positivo significa que se detectó el ADN genómico de Lawsonia intracellularis. No obstante, un resultado positivo en la PCR no implica necesariamente que la bacteria siga viva y siga replicándose. A pesar de ello, los ensayos con ARNm demuestran que los resultados positivos de la PCR realizada en animales infectados se correlacionan habitualmente con la infectividad del patógeno. La PCR disponible en estos momentos no permite diferenciar el ADN de la vacuna y el ADN natural.
¿Cómo optimizar los métodos de diagnóstico?
La figura 10 muestra el perfil serológico de una piara de cerdos obtenido con un ELISA de competición para detectar anticuerpos específicos contra Lawsonia intracellularis. Habitualmente la seroconversión puede detectarse entre las 16 y las 24 semanas de edad a través del aumento del porcentaje de inhibición (PI). Sin embargo, en otros ámbitos con una conformación de la piara distinta y otras condiciones de gestión, la seroconversión puede tener lugar antes.
En algunas granjas las cerdas jóvenes son reemplazadas a partir de una fuente que presenta una baja presión de Lawsonia intracellularis. En estas situaciones las cerdas jóvenes no expuestas al patógeno o muy sensibles pueden entrar en contacto con la bacteria durante la fase de aislamiento/adaptación, lo que puede desencadenar la patología aguda. Las pruebas serológicas pueden utilizarse para ser conscientes de la situación general, determinar el momento de la infección y controlar el riesgo. Durante el período de máxima exposición, es habitual encontrar seroprevalencias del 60-100 %. Aunque los niveles de anticuerpos disminuyen después del período máximo, pueden detectarse ejemplares positivos incluso en el momento del sacrificio.
Figura 10: Perfil colectivo de los anticuerpos contra L. intracellularis (ELISA de competición).
Lawsonia intracellularis es excretada en las heces alrededor de 2-4 semanas antes de la seroconversión. La prevalencia de las heces con resultado positivo puede alcanzar el 10-40 % durante esta etapa de la infección. A partir de ese momento la frecuencia disminuye de forma significativa y en el momento del sacrificio sólo se detectan animales positivos de forma aislada. El perfil inmunohistoquímico e histopatológico manifiesta una cinética similar. Las lesiones histopatológicas se reducen al parecer con el transcurso del tiempo y muestran una incidencia relativamente baja en el momento del sacrificio. El tratamiento antibiótico puede reducir significativamente la detección de los anticuerpos, así como del antígeno y del ADN de Lawsonia intracellularis.
V Ohlinger. bioScreen European Veterinary Disease Management Center. Alemania.
